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Unterschiedliche zelluläre Sortierung zweier viraler K+-Kanäle

Balß, Jörg :
Unterschiedliche zelluläre Sortierung zweier viraler K+-Kanäle.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2008)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Unterschiedliche zelluläre Sortierung zweier viraler K+-Kanäle
Language: German
Abstract:

Einige Membranproteine, so auch Kaliumkanäle, sind sowohl in der Plasmamembran wie auch in den Membranen diverser Organellen lokalisiert. In manchen Fällen ist ein und dasselbe Protein oder ein Isoform eines Proteins in der Plasmamembran und in unterschiedlichen Zellkompartimenten einschließlich der Mitochondrien vorzufinden. Dieses so genannte duale targeting ist vor allem vor dem Hintergrund bemerkenswert, dass Proteine der Plasmamembran und der Mitochondrien fundamental unterschiedliche Synthesewege haben. Zurzeit sind die genauen Mechanismen und Abläufe, die zur Sortierung ähnlicher Membranproteine in unterschiedliche Zielkompartimente führen noch weitgehend unverstanden und Erkenntnisziel zahlreicher Studien. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass zwei homologe virale Kaliumkanäle in heterologen Systemen wie Säugerzellen und Hefe einem unterschiedlichen targeting unterliegen. Aus der Analyse von Konfokalen-Laser-Mikroskopaufnahmen von HEK293 Zellen geht hervor, dass einer der beiden Kanäle, Kcv aus PBCV-1, in den sekretorischen Weg und zur PM gelangt, während der andere Kanal, Kesv aus EsV-1, in die Mitochondrien sortiert wird. Kesv trägt im N-Terminus eine typische mitochondriale Signalsequenz, die ein Reporterprotein (GFP) in die Mitochondrien leitet. Trotzdem benötigt Kesv dieses Signalpeptid nicht für seine Sortierung zu den Mitochondrien. Daher scheint ein weiteres dominantes Sortierungssignal im Protein enthalten zu sein. Vorhersagen über die Länge der Transmembrandomänen der untersuchten Kanäle deuten darauf hin, dass die zweite Membranhelix (TM2) von Kesv kürzer ist als die von Kcv. Verlängerungen der TM2 von Kesv mit mindestens einer Aminosäure führen dazu, dass das Kanalprotein nicht mehr in die Mitochondrien, sondern in den sekretorischen Weg sortiert wird. Als Folge des veränderten targetings konnte für einige Kesv-Mutanten, die in den sekretorischen Weg umgeleitet wurden, eine Kaliumkanalaktivität in der Plasmamembran in Hefekomplementationstest nachgewiesen werden. Da lediglich eine Verlängerung im C-terminalen Abschnitt von TM2 dazu in der Lage ist, eine solche Veränderung im Sortieren von Kesv hervorzurufen, scheint die Länge von TM2 alleine nicht ausschlaggebend für das veränderte targeting zu sein. Eine weitere Analyse von Chimären, die aus unterschiedlich großen Fraktionen der zwei Proteine zusammengesetzt waren, zeigte ferner, dass die TM2 des Proteins nicht alleine ausschlaggebend für die Proteinsortierung ist: Vielmehr wirkt die TM2 nur im Kontext von großen Teilen des gesamten Proteins als Sortierungssignal. Die gesammelten Daten lassen den Schluss zu, dass sowohl N- als auch C-terminale Bereiche im gefalteten Protein ein dreidimensionales Motiv bilden, das für das mitochondriale targeting verantwortlich ist. Bereits kleine strukturelle Veränderungen können bewirken, dass das targeting von Kesv von einer mitochondrialen Verteilung zu einer Sortierung in den sekretorischen Weg verändert wird. Da virale Proteine lediglich existierende zelluläre Mechanismen für ihre eigenen Bedürfnisse nutzen, ist anzunehmen, dass der hier gefundene Sortierungsvorgang auch für zelleigene Proteine relevant ist und dass somit kleinste strukturelle Unterschiede zwischen zwei Proteinen die Sortierung in unterschiedliche Zielkompartimente begründen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
A couple of membrane proteins including potassium channels are localized both at the plasma membrane and in membranes of several other cellular organelles. Sometimes the very same protein or its isoform can be found in the plasma membrane and in different subcellular compartments comprising the mitochondria. This so called dual targeting is exceptionally remarkable because proteins of the plasma membrane and the mitochondria are synthesized in two basal different manners. Presently the exact mechanisms and processes which manage a sorting of similar proteins into different cellular compartments are largely unknown but they are currently issues of several surveys. In the present study it is shown that two homologous viral potassium channels are targeted in a different manner in heterologous expression systems such as mammalian cell lines and yeast. Analysis of confocal laser scanning microscopy images of HEK293 cells indicates that either of the channels, Kcv from PBCV-1, attains the secretory pathway and the plasma membrane while the other channel, Kesv from EsV-1, is sorted to the mitochondria. The N-terminus of Kesv contains a typical mitochondrial signal sequence which is able to target a reporter protein (GFP) to the mitochondria. Nonetheless Kesv does not need the signal sequence to be sorted to the mitochondria. Hence the protein has to contain a further dominant signal. Predictions concerning the length of the studied proteins´ transmembrane domains point out that the second transmembrane domain (TM2) of Kesv is shorter than the TM2 of Kcv. Elongation of Kesv-TM2 with at least one amino acid results in a shift in localization of the channel protein from mitochondria to the secretory pathway. In consequence of the different targeting some Kesv mutants are redirected in the secretory pathway, and a potassium channel activity at the plasma membrane can be detected in yeast complementation assays. Since only an elongation in the C-terminal section of the TM2 causes a different sorting of Kesv the length of the TM2 cannot be the determining factor for modified targeting. Further analysis of chimeras consisting of variable fractions of both proteins showed again that the TM2 cannot be the determinant factor for protein sorting. The collected data suggest that both N- and C-terminal parts of the protein compose a three dimensional motif in the folded protein which is responsible for the mitochondrial targeting. Already small structural modifications can cause a shift from a mitochondrial localization to a sorting into the secretory pathway. Because viral proteins are using existing cellular mechanisms for their own purposes one could conclude that the discovered sorting process is also relevant for the cellular proteins and that only least structural modifications of proteins are necessary to target them into different cellular compartments.English
Uncontrolled Keywords: Duale Sortierung, Signalsequenz, Signalpeptid, Duales Targeting
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Duale Sortierung, Signalsequenz, Signalpeptid, Duales TargetingGerman
dual targeting, protein sorting, potassium channel, virus, signal sequence, signal peptide, mitochondria, plasma membrane, transmembrane domainEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:53
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000939
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-9398
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Homann, PD Dr. Ulrike
Advisors: Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 14 December 2007
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/939
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