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The role of miR-574-5p in the pathogenesis of rheumatoid arthritis

Hegewald, Anett B. (2021):
The role of miR-574-5p in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00009131,
[Ph.D. Thesis]

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Dissertation Anett Hegewald_190926 .pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: The role of miR-574-5p in the pathogenesis of rheumatoid arthritis
Language: English
Abstract:

Rheumatoid arthritis (RA) is a common chronic inflammatory joint disease, which leads to cartilage and bone damage as well as disability. To date, the complex aetiology of the disease is not completely understood. RA is characterized by swelling of the joints and infiltration of a variety of immune cells. The inflammation is mainly mediated by the communication of the cells within the affected joints via cytokines and other proinflammatory mediators. The discovery of small extracellular vesicles (sEVs) and their ability to mediate cell-to-cell communication has gained the interest of many research groups in the last decade. sEVs transport their cargo from delivering to recipient cells which has been demonstrated to play major roles in the pathogenesis of several diseases. The focus of sEV research was thereby mainly their involvement in cancer progression and the pathogenesis of inflammatory diseases such as RA. Progressive bone destruction by osteoclasts in the joints affected by RA may be the most severe alteration, as it is irreversible and can lead to complete loss of joint function. Therefore, the main objective of this study was to reveal new insights on the impact of sEV-delivered micro RNAs (miRs) in the context of osteoclast differentiation. MiRs are small non-coding RNAs which are one of the most important post-transcriptional repressors. However, alternative functions of miRs as post-transcriptional activators of gene expression and as ligands for endosomal ssRNA receptors like Toll-like receptor (TLR) 7 or TLR8 have been demonstrated recently. TLRs are receptors of the innate immune system. Their signalling leads to the translocation of the transcription factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells (NF-κB) and increased transcription of target genes.

In this thesis it was revealed that sEVs isolated from the synovial fluid of RA patients induce osteoclast differentiation in vitro in a time- and concentration dependent manner. Analysis of miR content revealed a high abundance of miR-574-5p in these sEVs in comparison to other miRs, such as miR-146a-5p or miR-155-5p. Synovial fibroblasts (SFs), which represent cells in synovial joints that play a major role in the progression of the disease, were identified as one of the sources of extracellular miR 574-5p present in the synovial fluid. In order to study the role of sEV-delivered miR-574 5p on osteoclastogenesis an overexpression (oe) tool was created, which provides an enrichment of miR-574-5p in sEVs. Stimulation of monocytic osteoclast precursor cells revealed that miR-574-5p oe sEVs induced osteoclast differentiation in a time dependent manner. This effect could be addressed to an activation of TLR7 and TLR8. To proof the binding of miR-574-5p to TLR8 a microscale thermophoresis assay (MST) was performed, which revealed a strong binding with a KD of 30.8 ± 5.2 nM. Furthermore, the inhibition of TLR7 and TLR8 abrogated the impact of miR 574 5p on osteoclast formation, indicating that this effect is mediated by TLR7/8 activation. Comparable results to those of the miR-574-5p oe sEVs were obtained with the synthetic TLR7/8 ligand Resiqiumod (R848). Here also a concentration- and time dependent effect on osteoclastogenesis was observed, supporting the general hypothesis that TLR7/8 activation can lead to an enhanced osteoclastogenesis. In addition, it was shown that the mRNA levels of several TLR7/8 target genes, such as interleukin 23 (IL-23), interferon alpha (IFNα) and microsomal prostaglandin E synthase-1 (mPGES-1) were upregulated in response to miR-574-5p oe sEVs. These effects could also be prevented by the inhibition of TLR7 and TLR8.

Overall, it was demonstrated in this thesis that sEV-delivered miR-574-5p enhances osteoclastogenesis by activating TLR7 and TLR8 in the context of RA. These findings provide the opportunity for novel treatment approaches for RA in patients in the future by targeting this mechanism.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine häufig auftretende, chronisch entzündliche Gelenkerkrankung, die zu Knorpel- und Knochenschäden sowie zu einer vollständigen Destruktion der Gelenke führen kann. Bis heute ist die komplexe Pathophysiologie der Krankheit nicht vollständig aufgeklärt. RA ist gekennzeichnet durch ein Anschwellen der Gelenke und die Infiltration einer Vielzahl von Immunzellen in die Gelenkkapseln. Die Entzündung wird hauptsächlich durch die Kommunikation der Zellen innerhalb der betroffenen Gelenke über Zytokine und andere proinflammatorische Mediatoren vermittelt. Die Entdeckung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) und ihrer interzellulären Kommunikationsfähigkeit, hat in den letzten zehn Jahren das Interesse vieler Forschungsgruppen geweckt. sEVs transportieren dabei ihren Inhalt von einer Absender- zu einer spezifischen Empfängerzelle und spielen nachweislich eine wichtige Rolle bei der Pathogenese verschiedener Krankheiten. Im Mittelpunkt der sEV-Forschung steht heute vor allem ihre Beteiligung an der Pathogenese von Entzündungskrankheiten wie RA sowie beim Tumorwachstum. Die fortschreitende Knochenzerstörung durch Osteoklasten in den von RA betroffenen Gelenken ist dabei möglicherweise die schwerwiegendste Veränderung, da sie irreversibel ist und zu einem vollständigen Funktionsverlust der Gelenke führen kann. Das Hauptziel dieser Doktorarbeit war es deshalb, neue Erkenntnisse über die Auswirkungen von sEV-vermittelten Mikro-RNAs (miRs) im Rahmen der Osteoklastendifferenzierung zu gewinnen. MiRs sind kleine, nicht-kodierende RNAs, die hauptsächlich für ihre Rolle als post-transkriptionelle Repressoren bekannt sind. Jedoch wurden in jüngster Zeit alternative Funktionen von miRs nachgewiesen, die sie als Aktivatoren der Genexpression oder als Liganden für endosomale einzelsträngige RNA-Rezeptoren wie Toll-like receptor (TLR) 7 oder TLR8 beschreiben. TLRs sind Rezeptoren des angeborenen Immunsystems und erkennen üblicherweise virale einzelsträngige RNAs. Bei Aktivierung durch einen Liganden wird eine nachfolgende Signaltransduktion eingeleitet, was zur Translokation des Transkriptionsfaktors kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells (NF-κB) und zur erhöhten Transkription von verschiedenen proinflammatorischen Zielgenen führt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sEVs, die aus der Synovialflüssigkeit von RA-Patienten isoliert wurden, fähig sind, in vitro die Osteoklastendifferenzierung in zeit- und konzentrationsabhängiger Weise zu induzieren. Die Analyse der Zusammensetzung dieser sEVs ergab einen hohen Anteil an miR-574-5p im Vergleich zu anderen miRs, wie beispielsweise miR-146a-5p oder miR-155-5p. Synoviale Fibroblasten (SFs), die eine wichtige Rolle bei der Progression der Erkrankung spielen, wurden dabei als eine der Hauptquellen dieser extrazellulären miR 574-5p in der Synovialflüssigkeit identifiziert. Um die Rolle von sEV-vermitteltem Transport von miR-574 5p bei der Osteoklastogenese zu untersuchen, wurde ein System zur Überexpression (oe) geschaffen, welches eine Anreicherung von miR-574-5p in sEVs ermöglicht. Die Stimulation monozytärer Osteoklastenvorläuferzellen zeigte, dass miR-574-5p oe sEVs die Differenzierung der Osteoklasten zeitabhängig induzierte. Dieser Effekt konnte auf eine Aktivierung von TLR7 und TLR8 zurückgeführt werden. Zum Nachweis der Bindung von miR-574-5p an TLR8 wurde ein microscale thermophoresis assay (MST) durchgeführt, der eine starke Bindung mit einem KD von 30,8 ± 5,2 nM ergab. Darüber hinaus konnte mit der Inhibierung von TLR7 und TLR8 der Einfluss von miR 574 5p auf die Osteoklastenbildung aufgehoben werden. Dies deutet darauf hin, dass dieser Effekt durch die Aktivierung von TLR7/8 vermittelt wird. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit dem synthetischen TLR7/8-Liganden Resiqiumod (R848) erzielt. Auch hier wurde ein konzentrations- und zeitabhängiger Effekt auf die Osteoklastogenese beobachtet, was die allgemeine Hypothese unterstützt, dass die TLR7/8-Aktivierung dies vermittelt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die mRNA-Level mehrerer TLR7/8-Zielgene, wie Interleukin 23 (IL-23), Interferon alpha (IFNα) und microsomal prostaglandin E synthase-1 (mPGES-1), als Reaktion auf die Stimulierung mit miR-574-5p oe sEVs hochreguliert wurden. Diese Effekte konnten auch durch die Inhibierung von TLR7 und TLR8 verhindert werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass durch eine Aktivierung von TLR7/8 ein sEV-vermittelter Transport der miR-574-5p zu einer Erhöhung der Osteoklastogenese führt. Diese neuen Erkenntnisse bieten die Möglichkeit, in Zukunft neue Behandlungsansätze für RA bei Patienten zu entwickeln, die auf diesen Mechanismus abzielen.German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 145 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Postranscriptional Gene Regulation and RNA Therapeutics
10 Department of Biology > Ribogenetics
Date Deposited: 22 Feb 2021 13:30
Last Modified: 22 Feb 2021 13:31
DOI: 10.26083/tuprints-00009131
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-91318
Referees: Saul, Dr. Meike J. and Suess, Prof. Dr. Beatrix
Refereed: 16 August 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/9131
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