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Struktur und Funktion respiratorischer Cytochrom c-Sulfitreduktase-Systeme

Eller, Jakob (2019):
Struktur und Funktion respiratorischer Cytochrom c-Sulfitreduktase-Systeme.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00009110,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Struktur und Funktion respiratorischer Cytochrom c-Sulfitreduktase-Systeme
Language: German
Abstract:

Sulfit bzw. Hydrogensulfit ist ein wichtiges Zwischenprodukt des Schwefelkreislaufs, als reaktive Schwefelverbindung aber auch ein Toxin. Das Epsilonproteobakterium Wolinella succinogenes verwendet für die Sulfit-Atmung und -Detoxifizierung die Oktahäm-Cytochrom c-Sulfit-Reduktase MccA, welche im mcc-Gencluster kodiert ist. Stromaufwärts von mccA sind die Gene des hypothetischen Zweikomponentensystems mccR und S lokalisiert. Stromabwärts von mccA liegen Gene, deren Produkte an der putativen Elektronentransportkette vom Chinonpool zu MccA beteiligt sein dürften (mccC und D), solche für die Reifung von MccA (mccB, ccsA1 und mccL) und solche mit unbekannter Funktion (mccE und F). Für den Elektronentransport zwischen respiratorischen Komplexen verwendet W. succinogenes Menachinon (MK) und dessen Derivat 8 Methylmenachinon (8-MMK), wobei letzteres aufgrund des negativeren Redoxpotentials des 8 MMK/8 MMKH2-Paares für die Sulfitatmung thermodynamisch günstiger ist. In dieser Arbeit wurde durch Leseraster-Mutation der Leserahmen von mccR in der Mutante W. succinogenes mccR+ cat verlängert, was im Gegensatz zum Wildstamm die gleichzeitige Atmung von Sulfit und Fumarat erlaubte. Derivate von W. succinogenes mccR+ cat mit einzelnen nichtpolaren Gendeletionen zeigten, dass mccB, C und D für die Sulfitatmung essenziell waren, während Zellen ohne mccL oder 8 MMK Sulfit mit verringerter Aktivität reduzierten. Die simultane Deletion von mccE und F hatte dagegen keinen Einfluss auf die Sulfitatmung. Eine Streptag-markierte Variante von MccA wurde unter der Kontrolle des mcc-Promotors in W. succinogenes produziert und gereinigt. Dessen Varianten, bei welchen eines der beiden Cu(I)-bindenden Cysteine durch Alanin ausgetauscht wurde, zeigten zwar dieselben spektroskopische Eigenschaften wie Wildstamm-MccA, waren zur Sulfitreduktion aber nicht in der Lage und enthielten kein Cu(I). Wildstamm-MccA wurde durch hohe Nitritkonzentrationen gehemmt, wohingegen das Cu(I)-lose MccA_C399A twS keine Substratinhibierung zeigte. Das Eisen-Schwefel-Protein MccC wurde heterolog in Escherichia coli produziert. Da es nur einen Teil der erwarteten [4Fe4S]-Zentren enthielt, wurde es anschließend in vitro rekonstituiert. MccL wurde sowohl in W. succinogenes als auch in E. coli produziert, gereinigt und der Kupfergehalt bestimmt. Durch in vitro-Rekonstitution war das Protein zusätzlich mit Cu(I) beladbar. Schließlich wurden MccA-Homologe und mcc Gencluster in Beta-, Gamma- und Deltaproteobakterien identifiziert und die Diversität der mcc-Gencluster untersucht. Insgesamt wurden die Cytochrom c-Sulfitreduktasen im bisher nicht erreichtem Detail untersucht und die Aufgaben der beteiligten Komponenten beleuchtet.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Sulfite or hydrogen sulfite respectively is an important intermediate of the sulfur cycle, but being a reactive sulfur compound it also resembles a toxin. The Epsilonproteobacteria member Wolinella succinogenes uses the octaheme cytochrome c sulfite reductase MccA for sulfite reduction and detoxification. This enzyme is coded in the mcc gene cluster. Upstream of mccA are the genes for the hypothetical two component system mccR und -S. Downstream of mccA are genes coding for a complex coupling sulfite reduction to the quinone pool (mccC and -D) as well as for maturation compounds of MccA (mccB, ccsA1, and mccL) and such of unknown purpose (mccE and -F). W. succinogenes uses menaquinone (MK) for transmembrane electron transport but also possesses the derivative 8-methylmenaquinone (8-MMK), whereas the ladder has a more negative redox potential and is thus favorable for sulfite respiration. In this work, the open reading frame of mccR was elongated via a frameshift mutation. In contrast to the wild type, cultures of the resulting mutant W. succinogenes mccR+ cat grew simultaneously with fumarate and sulfite as electron acceptors. From W. succinogenes mccR+ cat derived mutants with non-polar deletions of single open reading frames showed that mccB, -C and -D were essential for sulfite respiration, whereas the absence of mccL or 8-MMK resulted in diminished activity. Simultaneous deletion of mccE and -F had no effect on sulfite respiration. Strep-tag modified MccA was produced and isolated in W. succinogenes under control of the mcc-promoter. Its variants which had single or double substitutions of the putative Cu(I) binding cysteines to alanine showed the same optic properties as wild-type MccA but were unable to convert sulfite. MccA-twS was inhibited by high nitrite concentrations, however the copper-lacking variant MccA_C399A-twS did not show substrate inhibition by nitrite. The iron-sulfur-protein MccC was produced in Escherichia coli. Because the amount of [4Fe4S] clusters was lower than expected, it was reconstituted in vitro. MccL was produced in W. succinogenes as well as in E. coli and after isolation, its copper content was quantified. Protein could be loaded with additional copper via in vitro-reconstitution. Finally, MccA homologues and mcc gene clusters were identified in Beta-, Gamma-, Delta-, and Epsilonproteobacteria and analyzed according to their diversity. In summary, the cytochrome c sulfite reductases were investigated in hitherto unprecedented detail.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Microbial Energy Conversion and Biotechnology
Date Deposited: 17 Dec 2019 15:36
Last Modified: 09 Jul 2020 02:46
DOI: 10.25534/tuprints-00009110
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-91104
Referees: Simon, Prof. Dr. Jörg and Kletzin, PD Dr. Arnulf and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Kolmar, Prof. Dr. Harald
Refereed: 15 November 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/9110
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