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Die post-SELEX Optimierung des Trypanosomen-spezifischen RNA-Aptamers 2-16

Adler, Annette :
Die post-SELEX Optimierung des Trypanosomen-spezifischen RNA-Aptamers 2-16.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2007)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Die post-SELEX Optimierung des Trypanosomen-spezifischen RNA-Aptamers 2-16
Language: German
Abstract:

RNA-Aptamere sind biopolymere Verbindungen mit hochaffinen Bindeeigenschaften für spezifische Zielmoleküle. Sie stellen eine neue Stoffklasse bei der Entwicklung moderner Therapeutika dar und können sowohl direkt als auch indirekt zur Thera¬peutikaentwicklung eingesetzt werden. In der vorliegen¬den Arbeit wurden beide Strategien am Beispiel des Trypanosomen-spezifischen Aptamers 2-16 verfolgt: Ein direkter Einsatz von Aptamer 2-16 als trypanozide Substanz erfordert die Optimierung seiner pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaf¬ten. Aus diesem Grund wurden pharmakologisch relevante Charakteristika von Aptamer 2-16 moduliert. Hierzu wurde die nukleolytische Stabilität des Aptamers im menschlichen Serum durch die Inkorporierung von 2’-F- und/oder 2’-NH2-substituierten Pyrimidin¬nukleotiden auf Halbwertszeiten von bis zu mehreren Tagen erhöht. Die funktio¬nelle Analyse der 2’-modifizierten Aptamer-Varianten zeigte, dass ausschließlich 2’-F-dC/dU-substituierte Aptamer-Präparationen eine vergleichbare Bindeaffinität zu der des unmodifizierten Aptamers aufwiesen. Strukturanalysen belegten, dass die 2’-F-dC/dU-Modifikationen keinen signifikanten Einfluss auf die strukturelle Integrität des Aptamers ausübten, jedoch die thermische Stabilität des Moleküls erhöhen. Aptamer 2-16 wurde fortführend mit Polyethylenglycol-Derivaten unterschied¬licher molekularer Massen verknüpft. Die Aptamer-Konjugate zeigten im Ver¬gleich zum unmodifizierten Aptamer einen größen¬abhängigen Rückgang in ihrer Affinität. Die Konversion des Aptamers von einer in vitro bindenden Substanz hin zu einem therapeutisch aktiven Molekül erfolgte durch die kovalente Verknüpfung der RNA mit membranaktiven Substanzen. Ein Peptid~RNA-Konjugat wurde synthetisiert, das aus Aptamer 2-16 und dem membranaktiven Peptid GALA bestand. Dieses Konjugat wies eine Bindung an die trypanosomale Oberfläche auf und zeigte einen konzentrations¬abhängigen zytotoxischen Effekt auf Trypanosomenzellen. Ein indirekter pharmazeutischer Einsatz von Aptameren besteht in der Isolierung neuer therapeutischer Leitsubstanzen. Hierbei wurde Aptamer 2-16 genutzt, um Substanzbibliotheken nach Molekülen zu durchsuchen, welche dieselben Bindeeigenschaften wie das Aptamer aufwei¬sen. Dies wurde mit Hilfe von Verdrängungsexperimenten durchgeführt, in denen die Bindung des Aptamers in Gegenwart von 1028 Substanzen einer Naturstoffbibliothek analysiert wurde. Dabei konnte die Substanz Quercinsäure isoliert werden, die das Aptamer konzentrationsabhängig von der trypanoso¬malen Oberfläche verdrängt und demselben Bindemodus unterliegt wie das Aptamer.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
African trypanosomes are the causative agent of sleeping sickness. The therapeutics used to control and treat the disease are very ineffective and thus, the development of improved drugs is urgently needed. Recently, new strategies for the design of novel trypanocidals have been put forward. Among them are techniques that rely on parasite-specific RNA aptamers. RNA aptamers represent a novel class of biomolecular compounds that can be used for the design of therapeutically active molecules. Chemically they are intricately folded anionic polymers that are characterized by a high affinity and high specificity towards a defined target molecule. For the development of novel therapeutic strategies aptamers can be used directly as well as indirectly and here, both strategies were used using the trypanosome-specific RNA aptamer 2-16. The direct use of aptamer 2-16 as a trypanocidal compound required an optimization of its pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. To convert aptamer 2-16 into a serum-stable reagent 2'-deoxy-2'-F- and/or 2'-deoxy-2'-NH2-uridine and cytidine substituted RNAs were generated. While 2'-NH2-dC/dU modified RNAs were highly RNase-resistant, they were functionally inactive. By contrast, 2'-F-dC/dU substituted 2-16 RNAs retained their ability to bind to live trypanosomes indistinguishable from unmodified RNA. In addition, aptamer 2-16 was site-specifically PEGylated to increase its serum retention time. Conjugation with PEG polymers ≤10kDa only marginally impacted the binding characteristics of the RNA, while higher molecular mass PEG molecules resulted in non-functional aptamers. The conversion of aptamer 2-16 from an in vitro binding compound to a therapeutically active molecule was achieved by conjugating 2-16 RNA to membrane active compounds. A peptid~RNA-hybrid molecule was generated, consisting of aptamer 2-16 and the pH-dependent membrane disturbing 30 amino acid peptide GALA. The conjugate bound to the trypanosomal surface and showed a concentration-dependent cytotoxic effect towards live parasites. Instead of considering aptamers as drug leads themselves, they can be used indirectly in order to identify drug candidates from small-molecule chemical libraries. Competition binding experiments were performed to scrutinize a natural product library for compounds that are able to compete for aptamer binding to the trypanosomal surface. This led to the identification of the triterpenoid quercinic acid, which exhibits a concentration-dependent aptamer displacing activity and showed qualitatively the same binding characteristics as aptamer 2-16.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:53
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000892
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-8927
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich and Kolmar, Prof. Dr. Harald
Advisors: Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich
Refereed: 17 July 2007
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/892
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