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Der Einfluss von Anaerobie und von Glucose auf die Gasvesikelbildung in halophilen Archaea

Hechler, Torsten :
Der Einfluss von Anaerobie und von Glucose auf die Gasvesikelbildung in halophilen Archaea.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2007)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Der Einfluss von Anaerobie und von Glucose auf die Gasvesikelbildung in halophilen Archaea
Language: German
Abstract:

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Umweltfaktoren auf die Gasvesikelbildung in halophilen Archaea zu untersuchen. Die Synthese der Gasvesikel erfordert die Expression der sogenannten gvp-Gene, die in der vac-Region lokalisiert sind. In dem extrem halophilen Gasvesikelproduzenten Halobacterium (Hbt.) salinarum findet man zwei dieser Regionen (p-vac- und c-vac-Region), in dem moderat halophilen Gasvesikelproduzenten Haloferax (Hfx.) mediterranei dagegen nur die mc-vac-Region. Die gvp-Gene sind dabei jeweils in zwei entgegengesetzt orientierten Gengruppen angeordnet und stehen unter der Kontrolle der beiden Hauptpromotoren PA und PD. An der Regulation der Expression der Gasvesikelgene sind der Transkriptionsaktivator GvpE und das repressorisch wirkende GvpD beteiligt. Es war bereits bekannt, dass Hfx. mediterranei Gasvesikel in Abhängigkeit von der Salzkonzentration und von der Wachstumsphase bildet. Hbt. salinarum dagegen enthält unabhängig von der Salzkonzentration in jeder Wachstumsphase Gasvesikel. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von Sauerstoff und von Glucose auf die Bildung von Gasvesikeln in Hfx. mediterranei und Hbt. salinarum untersucht. Dabei wurden zusätzlich Transformationsstudien mit dem gasvesikelfreien Stamm Hfx. volcanii durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Hfx. mediterranei wie auch Hbt. salinarum unter anaeroben Bedingungen deutlich weniger Gasvesikel bilden als unter aeroben Bedingungen. Sowohl die Transkripte unter der Kontrolle des PA-Promotors wie auch des PD-Promotors waren in anaerob gewachsenen Zellen um den Faktor 10 im Vergleich zu aerob gewachsenen Zellen reduziert. Untersuchungen an Hfx. mediterranei ergaben, dass die Proteine GvpA, GvpD und GvpF unter anaeroben Bedingungen in deutlich geringeren Mengen vorhanden sind, als unter aeroben Bedingungen. In der ∆D-Transformante von Hfx. volcanii (enthält eine 918 bp großen Deletion im Gen mc-gvpD und damit kein funktionales GvpD Protein) war die Menge der Transkripte für die Strukturproteine der Gasvesikel sowie die GvpA-Menge unter anaeroben Bedingungen im Vergleich zu aeroben Bedingungen ebenfalls deutlich reduziert. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Reduktion der Gasvesikelbildung unter anaeroben Bedingungen unabhängig von dem repressorischen Protein GvpD stattfindet, und auch die Assemblierung der Gasvesikel betrifft. Neben dem Einfluss von Anaerobie wurde auch der Einfluss von Glucose und von einigen weiteren Zuckern (Hexosen, Pentosen und Disacchariden) auf die Gasvesikelbildung untersucht. Dies ergab sich aus der zufälligen Beobachtung, dass die Gasvesikelbildung in Hfx. mediterranei und mc-vac-Transformanten in Medien für anaerobes Wachstum inhibiert wurde, die neben Nitrat als terminalem Elektronenakzeptor auch Glucose enthielten. In mc-vac-Transformanten wurde in Glucosemedien die Menge der Transkripte für die Strukturproteine der Gasvesikel und die GvpA-Menge im Vergleich zu zuckerfreien Medien reduziert. Mit dem BgaH-Reportergen, das für ein halophiles Protein mit einer ß-Galaktosidase-Aktivität kodiert, wurde der Einfluss von Glucose auf die Aktivität der Promotoren PmcA und PmcD quantifiziert. Die BgaH-Aktivitäten in den Transformanten in Glucosemedien waren im Vergleich zu zuckerfreiem Wachstumsmedium um den Faktor 10 reduziert. Die Anwesenheit des Transkriptionsaktivators GvpE führte in PmcA-bgaH-Transformanten zu einer Abschwächung des inhibitorischen Effektes der Glucose. Mit der ∆D-Transformante konnte gezeigt werden, dass auch die glucose-induzierte Reduktion der Gasvesikelbildung unabhängig von GvpD stattfindet, und die Assemblierung der Gasvesikel betrifft. Anaerobie führte in Hbt. salinarum, Hfx. mediterranei und Hfx. volcanii-Transformanten zu einer Reduktion, bzw. völligen Unterdrückung der Gasvesikelbildung. Glucose inhibierte die Gasvesikelbildung nur in Hfx. mediterranei und Hfx. volcanii-Transformanten. In beiden Fällen findet die Regulation wahrscheinlich nicht nur auf genetischer Ebene statt, zusätzlich ist möglicherweise auch ein Schritt in der Assemblierung der Gasvesikel betroffen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The influence of environmental conditions on the gas vesicle formation in halophilic Archaea was investigated. The synthesis of gas vesicles involves the expression of the gvp-genes that are located in the so-called vac region. The extremely halophilic gas vesicle producer Halobacterium (Hbt.) salinarum contains two vac regions (p-vac and c-vac), whereas the moderately halophilic Haloferax (Hfx.) mediterranei contains only one vac region (mc-vac). The gvp-genes are arranged in two oppositely oriented gene clusters under the control of the two promoters PA and PD. The regulation of gene expression involves at least the transcriptional activator GvpE and the repressing protein GvpD. It is already known that the gas vesicle formation in Hfx. mediterranei is dependent on the growth phase and on the salt concentration. In the present work the influence of oxygen and of glucose on the gas vesicle formation in Hfx. mediterranei and Hbt. salinarum was investigated. Under anaerobic growth conditions, Hfx. mediterranei and Hbt. salinarum produced remarkably less gas vesicles than under aerobic growth conditions. The amount of transcripts produced under the control of the promoters PA and PD, was tenfold reduced in comparison to aerobically grown cells. In addition the amounts of gas vesicle proteins tested (GvpA, GvpD and GvpF) were also reduced under anaerobic conditions. Similar results were observed with a Hfx. volcanii ∆D transformant (which is not able to produce a functional GvpD repressor protein). Also the ∆D transformants were unable to produce gas vesicles under anaerobic conditions. However, the amount of gvpA-transcripts and also of the GvpA-protein was only slightly reduced. These findings demonstrated that the gas vesicle negative phenotype observed under anaerobic conditions was independent of GvpD and that the lack of gas vesicles was not due to reduced synthesis of GvpA, but rather to a defect in assembly of this structure. In addition the influence of glucose and of several other sugars (hexoses, pentoses and disaccharides) on gas vesicle formation was investigated. This aspect came out of the fortuitous observation that in media for anaerobic growth (containing nitrate as terminal electron acceptor and glucose to support anaerobic growth) the gas vesicle formation in Hfx. mediterranei and in Hfx. volcanii mc-vac transformants was already inhibited under aerobic growth conditions. The amount of gvp-transcripts and the amount of GvpA were strongly reduced in mc-vac transformants grown in glucose containing media. The influence of glucose on the activity of the two promoters PmcA and PmcD was measured using the bgaH-reporter gene, coding for a halophilic enzyme with a ß-galactosidase activity. The amount of BgaH activity was tenfold reduced compared to transformants grown in glucose-free media. Further experiments performed with the ∆D transformant showed that the glucose-induced reduction of gas vesicle formation was independent of GvpD and again, that the assembly of the gas vesicles was affected. While anaerobiosis led to a reduction or complete suppression of gas vesicle formation in Hbt. salinarum, Hfx. mediterranei and Hfx. volcanii transformants, glucose inhibited the gas vesicle formation in Hfx. mediterranei and Hfx. volcanii transformants only. In both cases, the inhibition was not only due to a regulation on the genetic level, but also the assembly of the gas vesicles was affected.English
Uncontrolled Keywords: Gasvesikel, halophile Archaea, Halophilie, TEM, Umwelteinflüsse, Anaerobie
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Gasvesikel, halophile Archaea, Halophilie, TEM, Umwelteinflüsse, AnaerobieGerman
gas vesicle, halophilic Archaea, TEM, environmental conditions, anaerobiosisEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:53
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000885
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-8859
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Kletzin, PD. Dr. Arnulf
Advisors: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Refereed: 19 October 2007
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/885
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