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Identification of regulatory RNA elements based on structural conservation

Braun, Johannes (2019):
Identification of regulatory RNA elements based on structural conservation.
Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

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Doktorarbeit Johannes Braun - Text
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Identification of regulatory RNA elements based on structural conservation
Language: English
Abstract:

The posttranscriptional regulation of gene expression determines the amount of a protein produced from a specific mRNA. All stages of the mRNA life cycle are posttranscriptionally regulated. The untranslated regions (UTRs) of mRNA play an important role in this process. UTRs encode cis-regulatory elements that interact with trans-acting factors such as RNA binding proteins or non-coding RNAs. These interactions are based on the specific recognition of sequence or structured motifs. Similar to the conservation of linear sequences, the conservation of secondary structures can be an indicative of a functional cis-regulatory element. In the first part of my doctoral thesis, I identified structurally conserved regulatory elements in 3’UTRs of mRNAs. For this, I performed reporter gene assays with bioinformatically predicted structurally conserved RNA elements and discovered a regulatory element in the 3’UTR of the UCP3 (uncoupling protein 3) mRNA. UCP3 is a protein of the inner mitochiondrial membrane and is associated with the development of diabetes melitus type 2 (T2DM). Through sequence and structural analysis, I discovered that the element has an active conformation that consists of two short RNA stem-loops. In further experiments, I was able to confirm that the presence of both RNA stem-loops is necessary for efficient regulation. Furthermore, I showed that the reduction of reporter gene expression is caused by a reduction of the mRNA half-life. The prediction of conserved RNA structures thus provides a powerful tool for the de novo identification of cis-regulatory elements. In the second part of my doctoral thesis, I characterized the regulatory element from the 3’UTR of UCP3 in detail. First, I performed RNA affinity purification to identify proteins specifically associated with the UCP3 element by mass spectrometry. This allowed me to show that the proteins Roquin-1 and Roquin-2 bind to the RNA stem loops of the UCP3 element. Furthermore, I showed that endogenous UCP3 is regulated by Roquin. Roquin proteins bind to constitutive (CDEs) and alternative (ADEs) decay elements and induce the rapid degradation of mRNAs of genes that play an important role in the immune response. Binding studies with the Roquin-1 ROQ domain showed that Roquin binds with significantly higher affinity to the UCP3 element, when both CDEs are present. Both CDEs in the UCP3 element do not correspond to the previously suggested CDE consensus. Performing a detailed mutational analysis, I revised the CDE consensus. With my data >160 new CDE- and 19 new ADE-coding mRNAs could be identified. Furthermore, I confirmed new CDE/ADE-containing mRNAs as targets of Roquin. Interestingly, I was able to show that not only the expression of CDEencoding mRNAs, but also regulation by Roquin is cell type dependent. In conclusion, I have extended Roquin’s role in the posttranscriptional regulation of gene expression and suggest that its role is not limited to the regulation of the immune response.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die posttranskriptionelle Regulation der Genexpression bestimmt maßgeblich die Menge eines Proteins, welches von einer bestimmten mRNA hergestellt wird. Alle Prozesse im Lebenszyklus einer mRNA werden posttranskriptionell reguliert. Eine besondere Rolle spielen dabei die nicht translatierten Bereiche (UTRs) der mRNA. UTRs kodieren cisregulatorische Elemente welche mit trans-agierende Faktoren wie RNA Bindeproteinen oder nicht-kodierenden RNAs interagieren. Diese Interaktionen basieren auf der spezifischen Erkennung von Sequenz- oder Strukturmotifen. Ähnlich wie die Konservierung von Sequenzen, kann auch die Konservierung von Sekundärstrukturen Hinweis auf ein funktionales cis-regulatorisches Element sein. Im ersten Teil meiner Doktorarbeit identifizierte ich strukturkonservierte, regulatorische Elemente in 3’UTRs der mRNA. Dazu führte ich Reportergenanalysen mit bioinformatisch vorhergesagten strukturkonservierten RNA Elementen durch und entdeckte ein regulatorisches Element im 3’UTR der UCP3 (uncoupling protein 3) mRNA. UCP3 ist ein mitochondriales Membranprotein und mit der Entstehung von Diabetes Melitus Typ 2 assoziiert. Durch Sequenz- und Strukturanalyse fand ich heraus, dass das Element eine aktive Konformation mit zwei kurzen RNA Stammschleifen einnimmt. In weiteren Experimenten konnte ich bestätigen, dass die Anwesenheit beider RNA Stammschleifen notwendig für die Regulation ist. Darüber hinaus zeigte ich, dass die Reduktion der Reportergenexpression durch eine drastische Verringerung der mRNA Halbwertszeit verursacht wird. Die Vorhersage konservierter RNA Strukturen, stellt somit ein effizientes Werkzeug zur de novo Identifikation cis-regulatorischer Elemente dar. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit untersuchte ich das regulatorische Element aus dem 3’UTR von UCP3 im Detail. Zunächst führte ich RNA Affinitätsaufreinigung durch um Proteine, die speziefisch mit dem UCP3 Element interagieren, mittels Massenspektromentrie zu identifizieren. Dadurch konnte ich zeigen, dass die Proteine Roquin-1 und Roquin-2 an die RNA Stammschleifen des UCP3 Elements binden. Darüber hinaus zeigte ich, dass endogenes UCP3 durch Roquin reguliert wird. Roquin Proteine binden an konstitutive (CDEs) und alternative (ADEs) Abbauelemente und induzieren eine schnellen Abbau der mRNA von Genen die eine wichtige Rolle bei der Immunantwort spielen. Bindungstudien mit der Roquin-1 ROQ Domäne zeigten, dass Roquin mit deutlich hö- herer Affinität an das UCP3 Element bindet, wenn beide CDEs vohanden sind. Beide CDEs im UCP3 Element entspechen nicht dem bisherigen Consesus für CDEs. Mit Hilfe einer Mutationsstudie revidierte ich den CDE Konsesus. Mit meinen Daten konnten >160 neue CDE- und 19 neue ADE-kodierende mRNAs identifiziert werden. Drüber hinaus bestätigte ich neue CDE/ADE-kodierende mRNAs als Ziele von Roquin. Interessanterweise konnte ich zeigen, dass nicht nur die Expression CDE-kodierender mRNAs, sondern auch die Regulation durch Roquin, Zelltyp abhängig ist. Durch meine Arbeit konnte die Rolle von Roquin in der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression erweitert werden und und gezeigt werden, dass die Regulation durch Roquin nicht auf Gene der Immunantwort beschränkt ist.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Molecular Genetics
10 Department of Biology > Postranscriptional Gene Regulation and RNA Therapeutics
10 Department of Biology > Ribogenetics
10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 23 Aug 2019 13:12
Last Modified: 23 Aug 2019 13:12
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-88278
Referees: Süss, Prof. Dr. Beatrix and Stein, Prof. Dr. Viktor
Refereed: 24 January 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8827
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