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Das Repressorprotein GvpD aus Haloferax mediterranei

Scheuch, Sandra :
Das Repressorprotein GvpD aus Haloferax mediterranei.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2007)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Das Repressorprotein GvpD aus Haloferax mediterranei
Language: German
Abstract:

Die Regulation der Gasvesikelbildung in halophilen Archaea wird durch mindestens zwei Proteine gewährleistet: GvpE ist ein Transkriptionsaktivator, der einem basischen Leucinzipper-Protein ähnelt, und GvpD ist an der Repression der Gasvesikelbildung beteiligt. Das GvpD-Protein weist in seiner Aminosäuresequenz ein p-loop-Motiv und zwei basische Regionen auf, die für seine Funktionalität entscheidend sind. Eine Interaktion der beiden Proteine mcGvpE und mcGvpD aus Haloferax mediterranei war bereits bekannt sowie eine Bindung von ATP an mcGvpD. Auch führt die gleichzeitige Anwesenheit von mcGvpD und mcGvpE in Haloferax volcanii-Transformanten zu einer starken Reduktion der mcGvpE-Menge und könnte somit den negativen Regulationsmechanismus der Gasvesikelbildung darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Deletionsmutanten des mcGvpD-Proteins hergestellt, um den mcGvpE-Interaktionsbereich genauer zu lokalisieren. Durch Bindungsstudien mit Deletionsmutanten im p-loop-Motiv konnte eine Beteiligung dieser Region an der Interaktion mit mcGvpE ausgeschlossen werden. Analysen mit weiteren mcGvpD-Deletionsmutanten zeigten, dass weder die N-terminale Region noch die C-terminale Region an der Interaktion mit mcGvpE beteiligt sind, sondern eher ein zentraler Bereich des Proteins. Der reduzierende Effekt von mcGvpD auf die Menge des mcGvpE-Proteins (oder auf das cGvpE-Protein von Halobacterium salinarum) wurde ebenfalls in Hfx. volcanii-Transformanten näher untersucht, um die hierfür notwendigen mcGvpD-Bereiche zu definieren. DEex-Transformanten, die die mc-gvpDE-Leserahmen unter der Kontrolle des fdx-Promotors in pJAS35 exprimieren, enthalten kaum mcGvpE. Zur leichteren Analyse der Wirkung verschiedener mcGvpD-Mutanten auf die mcGvpE-Menge wurde zunächst ein weiterer Expressionsvektor durch Inserierung des fdx-Promotors in pWL102 hergestellt. Die mcDex+mcEex- und mcDex+cEex-Doppeltransformanten, die beide Gene von verschiedenen Vektoren aus exprimierten, zeigten ebenfalls die mcGvpD-vermittelte Reduktion der GvpE-Menge. Eine verminderte mcGvpD-Menge wie in DEex-Transformanten konnte in den mcDex+Eex-Transformanten allerdings nicht beobachtet werden. Anhand der verschiedenen mcGvpD-Mutanten wurde deutlich, dass das p-loop-Motiv und die basische Region 1 für die mcGvpD-induzierte Reduktion der GvpE-Menge wichtig sind. Der reduzierende Effekt von mcGvpD findet nicht auf der Transkriptebene, sondern auf der Proteinebene statt. Alle mcGvpD-Mutanten, die die GvpE-Menge nicht reduzieren können, haben auch die Fähigkeit zur Repression der Gasvesikelbildung verloren, so dass die repressorische Wirkung des mcGvpD-Proteins offensichtlich in der Induktion der Degradation des Transkriptionsaktivators GvpE besteht. Ähnlich wie für mcGvpD wurden auch verschiedene cGvpE-Mutanten mit Substitutionen von konservierten Aspartatresten in mcDex+cEMutex-Transformanten auf ihre Stabilität hin untersucht. Keine der analysierten cGvpE-Mutanten war in Gegenwart des mcGvpD-Proteins stabil, wodurch eine Rolle dieser Aspartatreste als mögliche Modifikationsstelle für eine Markierung zur Degradation ausgeschlossen werden konnte. Erste Untersuchungen zur Quartärstruktur des mcGvpDhis-Proteins durch Gelfiltration, native Polyacrylamidgelelektrophorese und Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation deuteten an, dass das GvpDhis-Protein nicht nur in seiner monomeren Form, sondern als eine heterogene Mischung von oligomeren Komplexen mit unterschiedlichen molaren Massen vorliegt. Zusätzlich wurden auch mcGvpEhis und cGvpEhis hinsichtlich ihrer Quartärstruktur analysiert. All diese Proteine wurden jeweils sowohl in E. coli als auch in Hfx. volcanii produziert. Die in E. coli produzierten Proteine wurden denaturierend in 8 M Harnstoff gereinigt und durch Dialyse in 2,5 M KCl rückgefaltet. Der Vergleich der erhaltenen Ergebnisse zeigte, dass die hier untersuchten halophilen Proteine aus E. coli durch Dialyse nicht vollständig in ihre native Konformation überführt werden können. Bei der Reinigung von Gvphis-Proteinen aus Hfx. volcanii wurde ein weiteres, ca. 60 kDa großes Hfx. volcanii-Protein als Verunreinigung erhalten, das auch allein aus Hfx. volcanii gereinigt und durch N-terminale Sequenzierung als PitA identifiziert wurde (Bab-Dinitz et al., 2006). Dieses Protein weist eine interne Ansammlung von Histidinen auf, was seine Bindung an eine Ni-NTA-Matrix erklärt.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The regulation of gas vesicle formation in halophilic archaea is ensured through at least two proteins: GvpE is a transcriptional activator resembling a basic leucine-zipper protein, and GvpD is involved in the repression of gas vesicle formation. The amino acid sequence of the GvpD protein contains a p-loop motif and two basic regions, which are crucial for its functionality. An interaction of the two proteins mcGvpE and mcGvpD of Haloferax mediterranei was already known. The simultaneous presence of mcGvpD and mcGvpE in Haloferax volcanii transformants leads to a strong reduction in the amount of mcGvpE, and could therefore represent the negative regulatory mechanism of gas vesicle formation. Different deletion mutants of the mcGvpD protein were produced to localize the mcGvpE interaction site more precisely. A contribution of the p-loop motif to the interaction with mcGvpE could be ruled out, since mcGvpD p-loop deletion mutants were still able to bind mcGvpE. Analyses of additional mcGvpD deletion mutants showed that neither the N-terminal region nor the C-terminal region were involved in the interaction with mcGvpE, but rather a central portion of the protein. The reducing effect of mcGvpD on the amount of mcGvpE protein (or on the amount of cGvpE protein of Halobacterium salinarum) was also analysed in further detail in Hfx. volcanii transformants to determine the mcGvpD domains essential for this purpose. DEex transformants expressing the mc-gvpDE reading frames under fdx promoter control in pJAS35 contain barely detectable amounts of mcGvpE. For an easier analysis of the effect of different mcGvpD mutants on the amount of mcGvpE an additional expression vector was constructed by inserting the fdx promoter in pWL102. The mcDex+mcEex and mcDex+cEex transformants expressing both genes from different vector plasmids yielded the mcGvpD-mediated reduction in the amount of mcGvpE as well. However, a reduced mcGvpD amount as in DEex transformants could not be observed in the mcDex+Eex transformants. Analysing the different mcGvpD mutants it became clear that the p-loop motif and the basic region 1 were essential for the mcGvpD-induced reduction of GvpE. The reducing effect of mcGvpD does not occur at the transcript level, but at the protein level. All mcGvpD mutants able to reduce the amount of GvpE also lost their ability to repress gas vesicle formation. Thus, the repressive activity of mcGvpD is due to the induced degradation of GvpE. Also different cGvpE mutants with substitutions of conserved aspartate residues were analysed for their stability in mcDex+cEMutex transformants. None of these cGvpE mutants was stable in the presence of mcGvpD protein, whereby a role of these aspartate residues as possible modification site for degradation labelling could be ruled out. To obtain initial information on the quaternary structure of mcGvpDhis, gel filtration, native polyacrylamide gel electrophoresis and sucrose gradient density centrifugation were carried out. The results indicated that the mcGvpDhis protein was not only present as monomer, but as a heterogeneous mixture of oligomeric complexes with different molar masses. Furthermore, mcGvpEhis and cGvpEhis were analysed with respect to their quaternary structure as well. All these proteins were produced both in E. coli and in Hfx. volcanii. Proteins produced in E. coli were purified under denaturing conditions in 8 M urea and refolded through dialysis in 2.5 M KCl. The results indicated that proteins from E. coli cannot be converted completely in their native conformation by dialysis against high salt solutions. During the purification of Gvphis proteins from Hfx. volcanii, another 60 kDa protein was obtained as contamination that was identified as PitA by N-terminal amino acid sequencing (Bab-Dinitz et al., 2006). This protein exhibits an internal cluster of histidines what explains its binding to a Ni-NTA matrix.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:53
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000881
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-8811
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Kletzin, PD Dr. Arnulf
Advisors: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Refereed: 5 October 2007
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/881
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