TU Darmstadt / ULB / TUprints

Erstcharakterisierung des C‐Typ Lektin‐ähnlichen Glykoproteins Clr‐a

Rutkowski, Emilia (2019):
Erstcharakterisierung des C‐Typ Lektin‐ähnlichen Glykoproteins Clr‐a.
Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

[img]
Preview
Dissertation - Text
Dissertation_Rutkowski_Emilia_Version 00.pdf - Accepted Version
Available under CC-BY-NC-ND 4.0 International - Creative Commons, Attribution Non-commerical, No-derivatives.

Download (19MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Erstcharakterisierung des C‐Typ Lektin‐ähnlichen Glykoproteins Clr‐a
Language: German
Abstract:

In dieser Arbeit wird erstmalig das C‐Typ Lektin‐ähnliche Glykoprotein Clr‐a charakterisiert, welches durch das Gen Clec2e im Natürlichen Killer Genkomplex (NKC) der Maus kodiert wird. Neben Clr‐a sind noch weitere sechs Clr‐Moleküle sowie der Aktivierungsmarker CD69 als Mitglieder der CLEC2 Genfamilie in dieser Region des NKC kodiert, daneben auch die Nkrp1 Immunrezeptoren, denen einige Clr‐Moleküle als Liganden dienen. Die Analyse von diversen Mausgeweben ergab, dass Clec2e selektiv im Gastrointestinaltrakt, und zwar vorwiegend im Dünndarm und im Kolon, transkribiert wird. Die erstmalige Generierung von Clr‐a spezifischen monoklonalen Antikörpern im Rahmen dieser Arbeit ermöglichte sowohl die biochemische Charakterisierung des Clr‐a Glykoproteins als auch die Darstellung dessen darmspezifischer Expression. Ähnlich wie andere Vertreter der CLEC2 Familie, wie z. B. das eng verwandte Clr‐f, ist Clr‐a als Disulfid‐verknüpftes, glykosyliertes Homodimer auf der Zelloberfläche von Transfektanten nachweisbar. Im Gegensatz zu Clr‐f wird jedoch ein Großteil der Clr‐a Moleküle intrazellulär zurückgehalten. Durchflusszytometrische Analysen von Clr‐a/Clr‐f Hybridmolekülen identifizierten Teile der stalk‐Region sowie Teile der cytoplasmatischen Domäne der Clr‐a Glykoproteine als diejenigen Bereiche, die diese intrazelluläre Retention determinieren. Im Darmgewebe konnte mittels qPCR Analysen, Immunoblotting und Immunfluoreszenz eine prominente, homogene und exklusive Expression des Clr‐a Glykoproteins durch intestinale Epithelzellen in Krypten und Villi gezeigt werden. Versuche mit Reporterzellen, die Clr‐a Hybridrezeptoren exprimieren, sowie Bindungsversuche mit Clr‐a Fc-Fusionsproteinen lieferten keinen Nachweis für die Existenz eines Clr‐a Rezeptor. Eine postulierte Bildung von Heterodimeren durch Clr‐a mit dem ebenfalls selektiv im Darmepithel exprimierten Clr‐f wurde durch funktionelle Interaktionsstudien und die Analyse Clr‐f defizienter Mäusen weitgehend ausgeschlossen. Eine mittels Poly(I:C) Injektion künstlich induzierte Darmentzündung führte zu einer schnellen und drastischen Herabregulierung der Clr‐a Proteinexpression. In Versuchen mit knock‐out Mäusen konnte gezeigt werden, dass dieses entzündungsvermittelte Auslöschen der Clr‐a Expression durch den Immunrezeptor TLR3 vermittelt wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben erstmalig die spezifische Expression des NKC‐kodierten Glykoproteins Clr‐a im Darmepithel der Maus. Die drastische Expressionsmodulation bei einer Darmentzündung deutet wie auch die Zugehörigkeit zur CLEC2 Genfamilie auf eine Funktion von Clr‐a bei der Immunüberwachung des Darms hin.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In this work, the C-type lectin-like glycoprotein Clr-a, which is encoded by the gene Clec2e in the Natural Killer Gene Complex (NKC) of the mouse, is characterized for the very first time. In addition to Clr-a, another six Clr molecules and the activation marker CD69 are encoded as members of the CLEC2 gene family in this region of the NKC. The Nkrp1 immune receptors, for which some Clr molecules serve as ligands, are also encoded in this area. The analysis of various mouse tissues showed that Clec2e is selectively transcribed in the gastrointestinal tract, mainly in the small intestine and colon. The first time generation of Clr-a specific monoclonal antibodies in the context of this work enabled both the biochemical characterization of the Clr-a glycoprotein and the presentation of its gut-specific expression. Similar to other members of the CLEC2 family, such as the closely related Clr-f, Clr-a can be detected as a disulfide-linked, glycosylated homodimer on the cell surface of transfectants. In contrast to Clr-f, however, the majority of Clr-a molecules are retained intracellularly. Flow cytometric analyses of Clr-a/Clr-f hybrid molecules identified parts of the stalk region as well as parts of the cytoplasmic domain of Clr-a glycoproteins as those regions that determine intracellular retention. qPCR analysis, immunoblotting and immunofluorescence showed a prominent, homogeneous and exclusive expression of Clr-a glycoprotein by intestinal epithelial cells in crypts and villi in the intestinal tissue. Experiments with reporter cells expressing Clr-a hybrid receptors and binding experiments with Clr-a Fc fusion proteins did not provide evidence for the existence of a Clr-a receptor. A postulated formation of heterodimers by Clr-a with Clr-f also selectively expressed in the intestinal epithelium was largely excluded by functional interaction studies and the analysis of Clr-f deficient mice. An artificially induced intestinal inflammation by injection of poly(I:C) results in a rapid and drastic down-regulation of Clr-a protein expression. Experiments with knock-out mice showed that this inflammation mediated extinction of Clr-a expression is mediated by the immune receptor TLR3. The results of this work describe the specific expression of the NKC-encoded glycoprotein Clr-a in the intestinal epithelium of mice for the first time. The drastic modulation of expression in intestinal inflammation as well as affiliation to the CLEC2 gene family indicates a function of Clr-a in the immune surveillance of the intestine.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 05 Nov 2019 13:30
Last Modified: 05 Nov 2019 13:30
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-87539
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Steinle, Prof. Dr. Alexander
Refereed: 22 March 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8753
Export:
Actions (login required)
View Item View Item