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Enabling technologies for the generation of high-affinity binders based on immunoglobulin scaffolds

Grzeschik, Julius (2019):
Enabling technologies for the generation of high-affinity binders based on immunoglobulin scaffolds.
Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Enabling technologies for the generation of high-affinity binders based on immunoglobulin scaffolds
Language: English
Abstract:

Monoclonal antibodies (mAbs) emerged as one of the most successful and frequently used biotherapeutics over the last decade. For the discovery of antibodies, currently two approaches are predominant: Immunization of animals and surface display techniques. The first investigation in frame of the present cumulative study was focused on the optimization of yeast surface display by skipping the time-consuming staining of epitope tags required to verify fulllength presentation of displayed antibody fragments. For this reason a ribosomal skipping sequence enabling the translation of two separate proteins from one open reading frame was genetically incorporated between the displayed antibody fragment and a green fluorescent protein (GFP) as reporter protein. Translation of the protein of interest and the ribosomal skipping sequence (called 2A peptide) results in release of the N-terminally located antibody fragment from the polypeptide chain and secretion to the cell surface. The 2A peptide-mediated ribosomal skip re-initiates the translation of the GFP-encoding mRNA. Consequently, only yeast cells showing GFP fluorescence display the protein of interest. The combination of this system with the semi-synthetic shark-derived vNAR library emerged as a setup being efficient as the conventional procedure with the advantages of being more cost-efficient and less time-consuming. The second investigation evaluated the potential of yeast surface display (YSD) in combination with fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate high-affine and specific antibodies derived from a chicken immunization campaign. To this end, yeast-displayed recombinant antibody libraries from splenic mRNA of chickens immunized with epidermal growth factor receptor (EGFR) and human chorionic gonadotropin (hCG) were constructed as single chain variable fragments (scFv) by overlap extension polymerase chain reaction. A plethora of antigen binding scFvs were isolated in a convenient screening process. The production of target-specific variants as soluble scFv-Fc molecules enabled the subsequent extensive characterization by confirming high affinity, good specificity, thermostability and promising aggregation profiles. Furthermore, the biotechnological applicability of binders directed against both antigens could be demonstrated. For EGFR binders this could be achieved via specific cellular binding and for hCG-binders in the context of a lateral flow test by utilizing hCG-binding scFvs as capturing antibodies for pregnancy detection. In summary, the strategy using yeast surface display emerged as a powerful tool being able to expand the repertoire of display methods for the isolation of antibodies resulting from chicken immunization campaigns. The third investigation was focused on the development of a more convenient generation of yeastdisplayed Fab libraries. The conservative method for Fab library generation relies on using a three-step protocol including individual heavy- and light chain sub-libraries generated in haploid yeast strains followed by chain combination using yeast mating. The herein newly developed strategy bases on a Golden Gate cloning approach resulting in diversities of both heavy and light chain being efficiently combined on one single plasmid using a bidirectional promoter. The applicability of this system could be verified by two individual successful screening campaigns. The first investigation enabled the isolation of high-affine human antibodies resulting from immunized transgenic rats. Furthermore, it could be proven that the method can also be used to successfully screen and isolate chimeric chicken/human antibodies after avian immunization. In the end it could be shown that the Golden Gate based one-step process enables the delivery of libraries and antibodies from heavy- and light chain diversities with comparable quality to the conventional method while being significantly less time-consuming and complex. The last part of this work elucidated the potential usage of shark-derived single chain antibodies (vNARs) to be used for specific lymphoma cell targeting. It could be shown in previous studies that a shark-derived semi-synthetic CDR3 loop randomized yeast library is suited pretty well to isolate antiidiotype binders recognizing exclusively the paratope of mABs. Lymphoma cells might be an attractive target for anti-idiotype vNAR molecules since B-cell lymphoma cells exhibit tumor-specific and functionally active B-Cell receptors (BCR). However, targeting BCRs for lymphoma therapy has shown to be demanding since the BCR differs from patient to patient. For this reason in the presented study we evaluated the rapid and convenient isolation of specific BCR-binding vNARs derived from the semisynthetic library. To this end the BCRs of three different lymphoma cell lines Daudi, SUP-B8, and IM-9 were identified, followed by reformatting the variable domains and expression of the resulting BCRs as monoclonal antibodies. The SUP-B8 BCR was consequently utilized as antigen in a FACS-based screening of the yeast-displayed vNAR libraries resulting in the enrichment of several antigen-binding vNARs. Further characterization of the isolated vNARs after reformatting as Fc fusion proteins confirmed an affine and specific binding to both the soluble recombinantly expressed BCR molecules and the respective lymphoma cell line. Initial experiments to exploit the specific BCR-binding for BCRclustering followed by induction of cell apoptosis did not show a significant influence on cell viability. However, an alternative approach that includes the generation of multivalent vNAR constructs or the construction of vNAR antibody-drug conjugates might enable a vNAR-induced patient-specific lymphoma cell killing in the future.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Monoklonale Antikörper (mAbs) haben sich über die letzten Jahre als eine der erfolgreichsten und am häufigsten verwendeten Biotherapeutika erwiesen. Für die Entdeckung von Antikörpern sind derzeit zwei Ansätze vorherrschend: Die Immunisierung von Tieren und Oberflächendisplay-Techniken, wie beispielsweise das Hefe-Display. Die erste Untersuchung im Rahmen der hier vorliegenden kumulativen Dissertation konzentrierte sich auf die Optimierung des Präsentationsnachweises beim Hefe-Display durch Umgehen der zeitaufwändigen Färbung von Protein-Anhängseln. Dies ist im konventionellen Hefe-Display nötig zur Verifizierung der Präsentation von Antikörperfragmenten in voller Länge ohne Insertionen oder vorzeitige Stoppcodons. Aus diesem Grund wurde eine ribosomale Überspringsequenz, die die Translation von zwei separaten Proteinen aus einem offenen Leserahmen ermöglicht, genetisch zwischen dem zu präsentierenden Antikörperfragment und einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) als Reporterprotein eingebaut. Die Translation des zu präsentierenden Antikörperfragments und der ribosomalen Überspringsequenz (als 2A-Peptid bezeichnet) führt zur Freisetzung des N-terminal lokalisierten Antikörperfragments aus der Polypeptidkette und der Translokation auf die Zelloberfläche. Der 2A-Peptid-vermittelte ribosomale Sprung löst die Translation der GFP-kodierenden mRNA erneut aus. Folglich zeigen nur Hefezellen, die GFP-Fluoreszenz zeigen, das jeweilige Antikörperfragment in voller Länge. Die Kombination dieses Systems mit der von Haien abgeleiteten halbsynthetischen vNAR-Bibliothek erwies sich als ebenso effizientes Vorgehen wie das herkömmliche Verfahren mit den Vorteilen, dabei kostengünstiger und weniger zeitaufwändig zu sein. In der zweiten Untersuchung wurde die Anwendbarkeit des Hefedisplays in Kombination mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) zur Isolierung hochaffiner und spezifischer Antikörper nach einer Immunisierungskampagne von Hühnern untersucht. Zu diesem Zweck wurden rekombinante Antikörperbibliotheken aus der mRNA der Milz von Hühnern, die mit dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) und humanem Choriongonadotropin (hCG) immunisiert wurden, als single chain variable fragments (scFv) durch Overlap Extension PCR konstruiert. Eine Vielzahl von Antigen-bindenden scFvs wurde in einem geeigneten Screening- Verfahren isoliert. Die Herstellung zielspezifischer Varianten als lösliche scFv-Fc-Moleküle ermöglichte die anschließende umfassende Charakterisierung durch Bestätigung der hohen Affinität, guten Spezifität, Thermostabilität und vielversprechender Aggregationsprofile. Darüber hinaus konnte die biotechnologische Anwendbarkeit von gegen beide Antigene gerichteten Bindemolekülen demonstriert werden. Für EGFR-Binder könnte dies durch spezifische zelluläre Bindung und für hCG-Binder im Rahmen eines Lateral-Flow-Tests erreicht werden, in dem hCG-bindende scFvs als Fänger-Antikörper für den Schwangerschaftsnachweis verwendet wurden. Zusammenfassend stellte die Strategie der Verwendung von Hefe-Display ein wirksames Instrument dar, mit dem das Repertoire an Displaymethoden für die Isolierung von Antikörpern nach Hühnerimmunisierungskampagnen erweitert werden konnte. Die dritte Untersuchung konzentrierte sich auf die Entwicklung der effektiveren Erstellung von über Hefe-Display präsentierten Fab Fragment Bibliotheken. Die konservative Methode für die Fab-Bibliotheksgenerierung beruht auf der Verwendung eines dreistufigen Protokolls, das einzelne Subbibliotheken der schweren und leichten Kette umfasst, die in haploiden Hefestämmen erzeugt werden, gefolgt von einer zufälligen Kettenkombination durch Anwendung von Hefepaarung. Die hier neu entwickelte Strategie basiert auf einem Golden Gate-Klonierungsansatz, der dazu führt, dass Diversitäten sowohl der schweren als auch der leichten Kette auf einem einzigen Plasmid unter Verwendung eines bidirektionalen Promotors effizient kombiniert werden. Die Anwendbarkeit dieses Systems konnte durch zwei erfolgreiche Einzelkampagnen bestätigt werden. Die erste Untersuchung ermöglichte die Isolierung hochaffiner humaner Antikörper aus immunisierten transgenen Ratten. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass das Verfahren auch verwendet werden kann, um chimäre Huhn / Human-Antikörper nach der Immunisierung von Hühnern erfolgreich zu durchmustern und zu isolieren. Am Ende konnte gezeigt werden, dass das auf einem Golden Gate- Verfahren basierende Ein-Schritt-Verfahren die Erstellung von Bibliotheken und die Isolierung von Antikörpern aus schweren und leichten Ketten mit vergleichbarer Qualität der konventionellen Methode ermöglicht, während es wesentlich weniger Zeitaufwand erfordert und weniger komplex ist. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die potenzielle Verwendung von Einzelketten-Antikörpern aus Haien (vNARs) für die spezifische Targetierung von Lymphomzellen untersucht. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass eine vom Hai stammende halbsynthetische Hefebibliothek sehr gut geeignet ist, Anti-Idiotyp-Binder zu isolieren, die ausschließlich das Paratop von mABs erkennen. Lymphomzellen könnten ein attraktives Ziel für anti-idiotypische vNAR-Moleküle sein, da B-Zell- Lymphomzellen tumorspezifische und funktionell aktive B-Zell-Rezeptoren (BCR) aufweisen. Die Targetierung von BCRs für die Lymphomtherapie hat sich jedoch als anspruchsvoll erwiesen, da sich die BCRs von Patient zu Patient unterscheiden. Aus diesem Grund wurde in der vorgestellten Studie die schnelle und bequeme Isolierung spezifischer BCR-bindender vNARs aus der halbsynthetischen Bibliothek untersucht. Zu diesem Zweck wurden die BCRs der drei verschiedenen Lymphomzelllinien Daudi, SUP-B8 und IM-9 identifiziert. Anschließend wurden die variablen Domänen reformatiert und die resultierenden BCRs als monoklonale Antikörper exprimiert. Der SUP-B8-BCR wurde im Anschluss als Antigen in einer FACS-basierten Durchmusterung der auf Hefe präsentierten vNAR-Bibliotheken verwendet, was in einer Anreicherung mehrerer antigenbindender vNARs resultierte. Die weitere Charakterisierung der isolierten vNARs nach der Reformatierung als Fc-Fusionsproteine bestätigte eine affine und spezifische Bindung sowohl an die löslich rekombinant exprimierten BCR-Moleküle als auch an die originale Lymphomzelllinie. Anfängliche Experimente zur Ausnutzung der spezifischen BCRBindung für das BCR-Clustering, gefolgt von der Induktion der Zellapoptose, zeigten keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Ein alternativer Ansatz, der die Erzeugung multivalenter vNAR-Konstrukte oder die Konstruktion von vNAR-Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten einschließt, könnte jedoch in Zukunft eine vNAR-induzierte Abtötung von patientenspezifischen Lymphomzellen ermöglichen.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 29 May 2019 06:58
Last Modified: 09 Jul 2020 02:36
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-86987
Referees: Kolmar, Prof. Harald and Süß, Prof. Beatrix
Refereed: 11 February 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8698
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