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Identification and impact of Topoisomerase II β induced DNA double-strand breaks in Glioblastoma multiforme: NMDA-receptor signaling pathway as target structure

Lutz, Henrik :
Identification and impact of Topoisomerase II β induced DNA double-strand breaks in Glioblastoma multiforme: NMDA-receptor signaling pathway as target structure.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2019)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Identification and impact of Topoisomerase II β induced DNA double-strand breaks in Glioblastoma multiforme: NMDA-receptor signaling pathway as target structure
Language: English
Abstract:

Glioblastoma multiforme (GBM) is a highly lethal and incurable cancer of the central nervous system and current therapies are challenged by GBMs invasive growth and chemo-radioresistance. Ca2+-permeable N-Methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) are important for synaptic transmission of excitatory neurons and essentially regulate the plasticity of our brain via activation of several NMDAR-dependent signaling pathways. However, NMDARs have been shown to contribute to GBMs malignancy by promoting growth, survival and migration. Although the impact of NMDARs on GBM has been clearly demonstrated, the particular signaling pathways used by GBM are poorly known. The identification of the NMDAR signaling pathways used by GBM cells might therefore help to develop NMDAR-targeted cancer therapies which highly impact GBM cells but do not disrupt synaptic transmission in neurons. The NMDAR-dependent expression of early-response genes (ERGs) upon neuronal activity is essential for synaptic plasticity and the formation of long term memory. The expression of ERGs depends on NMDAR-induced DNA-double strand breaks (DSBs) in the transcriptional start site of these genes. Some neuronal ERGs encode for proto-oncogenes like cFos, suggesting that GBM cells might hijack NMDAR signaling pathways to promote proto-oncogenes expression. In order to investigate the impact of NMDAR-dependent ERG expression in GBM cells we intended to identify the hallmark of this NMDAR signaling pathway: The induction of NMDAR-dependent and Topoisomerase II β (Top2β) mediated DSBs in GBM cells. For this task we validated the expression of NMDARs and functional Ca2+ signaling in the LN229 GBM cell line, which revealed functional NMDAR signaling in LN229 cells. Immunofluorescence staining of the DSB marker 53BP1 showed that NMDARs activation induces DSBs in a subpopulation of GBM cells and that DSB induction depends on Top2β activity, which demonstrates an analogues NMDAR signaling pathway in GBM cells and neurons. Analysis of ERG expression revealed that NMDARs, the cAMP-responsive element binding transcription factor (CREB) and Top2β all contribute to the expression of cFos and the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in GBM cells. Inhibition of Top2β or NMDARs also impaired the expression of cFos in a primary GBM cell line. In a clonogenic survival assay knock-down of Top2β with siRNAs and inhibition of NMDARs decreased LN229 cells resistance to X-rays. Additionally, a newly discovered interplay of NMDAR signaling and IR damage response on the expression of BDNF and cFos might explain the high impact of NMDAR inhibition on radiosensitivity. Interestingly, inhibition of DNA-dependent protein kinase indicates that NMDAR-mediated transcription involves factors required in DSB repair, suggesting an important role for DNA repair in NMDAR-mediated transcriptional regulation. The results presented in this work demonstrate a functional Top2β-dependent NMDAR signaling pathway in GBM cells. The radiosensitizing effect of Top2β and NMDAR inhibition reveals that targeting NMDAR-dependent and Top2β-mediated ERG expression might be a promising strategy for GBM therapy.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Glioblastoma multiforme (GBM) ist ein hoch letaler und unheilbarer Krebs des zentralen Nervensystems und sein invasives Wachstum und die Chemo-Radioresistenz stellen eine Herausforderung für die derzeitigen Therapien gegen GBM dar. Ca2+-permeable N-Methyl-D-Aspartat Rezeptoren (NMDARs) sind wichtig für die synaptische Übertragung von exzitatorischen Neuronen und regulieren im Wesentlichen die Plastizität unseres Gehirns durch Aktivierung verschiedener NMDAR-abhängiger Signalwege. Es hat sich jedoch gezeigt, dass NMDARs durch die Förderung von Wachstum, Überleben und Migration zur Malignität von GBM beitragen. Obwohl die Auswirkungen von NMDARs auf GBM eindeutig nachgewiesen wurden, sind die von GBM verwendeten Signalwege im Einzelnen nur wenig bekannt. Die Identifizierung der von GBM-Zellen genutzten NMDAR-Signalwege, könnte daher dabei helfen NMDAR-gerichtete Krebstherapien zu entwickeln, welche stark auf GBM-Zellen wirken, aber die synaptische Übertragung von Neuronen nicht unterbrechen. Die NMDAR-abhängige Expression von early response genes (ERGs) in Folge von neuronaler Aktivität ist essentiell für die synaptische Plastizität und die Bildung von Langzeitgedächtnis. Die Expression von ERGs hängt von NMDAR-induzierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) in der transkriptionellen Startstelle dieser Gene ab. Einige neuronale ERGs kodieren für Protoonkogene wie cFos, was darauf hindeutet, dass GBM-Zellen NMDAR Signalwege missbrauchen könnten, um die Expression von Protoonkogenen zu fördern. Um die Auswirkungen der NMDAR-abhängigen ERG-Expression in GBM-Zellen zu untersuchen, wollten wir das besondere Kennzeichen dieses NMDAR-Signalwegs identifizieren: Die Induktion von NMDAR-abhängigen und Topoisomerase II β (Top2β) vermittelten DSBs in GBM-Zellen. Für diese Aufgabe haben wir die Expression von NMDARs und funktionelle Ca2+-Signale in der LN229 GBM-Zelllinie validiert, was eine funktionelle NMDAR-Signalweiterleitung in LN229-Zellen ergab. Die Immunfluoreszenzfärbung des DSB-Markers 53BP1 zeigte die Aktivierung von NMDARs-induzierten DSBs in einer Subpopulation von GBM-Zellen und dass die DSB Induktion von der Top2β-Aktivität abhängt, was einen analogen NMDAR-Signalweg in GBM-Zellen und Neuronen zeigt. Die Analyse der ERG-Expression ergab, dass NMDARs, cAMP-responsive element binding transcription factor (CREB) und Top2β alle zur Expression von cFos und dem brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in GBM-Zellen beitragen. Die Inhibition von Top2β oder NMDARs beeinträchtigte auch die Expression von cFos in einer primären GBM-Zelllinie. In einem klonogenen Überlebensassay verringerte der Knock-down von Top2β mittels siRNAs und die Inhibition von NMDARs die Resistenz von LN229-Zellen gegen Röntgenstrahlen. Zusätzlich könnte ein neu entdecktes Zusammenspiel von NMDAR-Signalweiterleitung und IR-Schadensantwort auf die Expression von BDNF und cFos den hohen Einfluss der NMDAR-Inhibition auf die Strahlungsempfindlichkeit erklären. Interessanterweise zeigt die Inhibition der DNA-abhängigen Proteinkinase, dass die NMDAR-vermittelte Transkription Faktoren beinhaltet, welche für die DSB-Reparatur erforderlich sind, was auf eine wichtige Rolle der DNA-Reparatur für die NMDAR-vermittelten Transkriptionsregulation hinweist. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse zeigen einen funktionellen Top2β-abhängigen NMDAR-Signalweg in GBM-Zellen. Die radiosensibilisierende Wirkung durch die Inhibition von Top2β und NMDAR zeigt, dass die gezielte Inhibition der NMDAR-abhängigen und Top2β-vermittelten ERG-Expression eine vielversprechende Strategie für die GBM-Therapie sein könnte.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Neurophysiology and Neurosensory Systems
Date Deposited: 19 Aug 2019 13:47
Last Modified: 19 Aug 2019 13:47
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-86783
Referees: Laube, Prof. Dr. Bodo and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 4 July 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8678
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