TU Darmstadt / ULB / TUprints

Development of RNA aptamers and synthetic riboswitch using Capture-SELEX

Boussebayle, Adrien :
Development of RNA aptamers and synthetic riboswitch using Capture-SELEX.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2018)

[img]
Preview
Text
PhD thesis Adrien Boussebayle.pdf - Published Version
Available under CC-BY-SA 4.0 International - Creative Commons, Attribution Share-alike.

Download (5MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Development of RNA aptamers and synthetic riboswitch using Capture-SELEX
Language: English
Abstract:

RNA is a key molecule for living organism in all kingdom of life. A major task performed by RNA is the regulation of gene expression. One of the strategies adopted by RNA to control and adapt gene expression to the environment of the cell, is the use of riboswitches that can activate or inhibit gene expression in response to changes in the presence of a specific molecule. Riboswitches are composed of two domains, one where binding of the target happens is called the aptamer and the other domain is called expression platform. Based on this principle, scientists could engineer synthetic riboswitches using in vitro selected aptamers by a technique called SELEX. So far, several synthetic riboswitches have been developed but they are still a few compared to natural riboswitches. One of the causes is not the lack of aptamers that recognize a target molecule, but that most of these aptamers are not suitable for riboswitch engineering. In fact, the majority of in vitro selected aptamers are not able to regulate gene expression. It requires the aptamers undergo a conformational change during ligand binding. In classical SELEX, however, only binding and not conformational changes are selected. Recently a new technique was developed for DNA, called Capture-SELEX allowing the selection of structure switching aptamers against small molecules in solution. The first part of this work included the development and the adaptation of Capture-SELEX for RNA. A complete adaptation of the protocol was needed to perform this SELEX with RNA. Some improvements were designed compared to the original protocol to increase efficiency that lead to a first successful enrichment towards neomycin. Improvements was mostly done aiming a better elution of specific binders but also the decrease of non-specific recovered sequence during the selection. A heat elution step was introduced to remove weak binders, shorten the time of specific elution, select only aptamers with a fast kon and optimize the design of the library. Thanks to these modification, selection against different types of molecules could be successfully achieved and their characterisation revealed the development of aptamers with high binding affinity and specificity. As the main goal of this project was the development of synthetic riboswitches, the paromomycin enriched SELEX library was used to screen for in vivo active sequences. After the screening of about 1200 different candidates, several hits were found and one candidate was selected for further engineering. he secondary structure of this candidate was analysed by inline probing and a ligand binding was determined by ITC measurement of KD=21 nM. High specificity towards its target could be shown both in vitro and in vivo. The candidate was then used for partial randomisation to search for improved mutants. By combining several of these mutations, a paromomycin specific riboswitch with 8.5-fold regulation could be engineered. Further engineering was performed based on the structural analysis to exchange a part of the riboswitch with the neomycin riboswitch for the assembly of an in vivo NOR Boolean logic gate resulting in 30-fold regulation.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
RNA ist ein Schlüsselmolekül für alle lebenden Organismus. Eine wichtige Aufgabe der RNA in der Zelle ist die Regulation der Genexpression. Eine der Strategien, die von der RNA zur Kontrolle und Anpassung der Genexpression an die Umgebung der Zelle verfolgt wird, ist durch Riboswitche, die die Genexpression als Antwort auf die Gegenwart eines bestimmten Moleküls aktivieren oder hemmen können. Riboswitche bestehen aus zwei Teilen, eine sensorische Domäne, in der die Bindung des Zielmoleküls erfolgt, genannt auch Aptamerdomäne und der Expressionsplattform, die die Genexpression beeinflusst. Basierend auf diesem Prinzip konnten Wissenschaftler künstlich synthetische Riboswitch mit in vitro selektierten Aptameren unter Verwendung einer Technik namens SELEX entwickeln. Bislang wurden mehrere synthetische Riboswitches entwickelt, aber es sind immer noch einige wenige im Vergleich zu natürlichen Riboswitches. Eine der Ursachen ist nicht das Fehlen von Aptameren, die ein Zielmolekül erkennen, sondern dass die meisten dieser Aptamere nicht für den Aufbau von Riboswitchen geeignet sind. Tatsächlich ist die Mehrzahl der in vitro selektierten Aptamere nicht in der Lage, die Genexpression zu regulieren. Hierzu ist es nötig, dass die Aptamere bei Ligandenbindung eine Konformationsänderung erfahren. In der klassischen SELEX wird jedoch nur auf Bindung und nicht auf Konformationsänderung selektiert. Vor kurzem wurde eine neue SELEX-Methode entwickelt, Capture-SELEX genannt, die die Auswahl von strukturschaltenden Aptameren gegen kleine Moleküle in Lösung ermöglicht, allerdings für ssDNA und nicht für RNA. Der erste Teil dieser Arbeit beinhaltete die Entwicklung und Anpassung der Capture-SELEX für RNA. Eine vollständige Anpassung des Protokolls war erforderlich, um diese SELEX nun mit RNA durchzuführen. Weiterhin wurden einige Optimierungsschritte durchgeführt, um die Effizienz zu erhöhen, die zu der ersten erfolgreichen Anreicherung von Aptameren führte, die Neomycin erkennen. Verbesserungen wurden hauptsächlich mit dem Ziel vorgenommen, eine bessere Elution spezifischer Binder zu erreichen, aber auch den Anteil unspezifischer Sequenzen während der Selektion zu verringern. Hierzu wurde ein Hitzeelutionsschritt eingeführt, um schwache Binder zu entfernen, die Zeit der spezifischen Elution verkürzt, um nur Aptamere mit einem schnellen kon auszuwählen und das Design der Bibliothek optimiert. Dank dieser Modifikation konnte die Selektion gegen verschiedene Arten von Molekülen erfolgreich durchgeführt werden und ihre Charakterisierung zeigte die Entwicklung von Aptameren mit hoher Affinität und Spezifität. Da das Hauptziel dieses Projekts die Entwicklung synthetischer Riboswitches war, wurde die mit Paromomycin angereicherte SELEX-Bibliothek zum Screening nach in vivo aktiven Sequenzen verwendet. Nach dem Screening von ca. 1200 verschiedenen Kandidaten wurden mehrere Treffer gefunden und ein Kandidat für das weitere Engineering ausgewählt. Von diesem Kandidaten wurde die Sekundärstruktur durch inline Probing analysiert und eine Ligandenbindung durch ITC-Messung von KD=21 nM bestimmt. Eine hohe Spezifität gegenüber dem Target konnte sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden. Mit diesem Kandidaten konnte nicht nur die Expression von GFP, sondern auch von mCherry regulieren werden. Der Kandidat wurde anschließend für die partielle Randomisierung verwendet, um nach verbesserten Mutanten zu suchen. Durch die Kombination mehrerer dieser Mutationen konnte ein Paromomomycin-spezifischer Riboswitch mit einer 8,5-fachen regulatorischen Aktivität entwickelt werden. Basierend auf der Strukturanalyse wurde ein Teil des Riboswitches mit dem Neomycin-Riboswitch für die Erstellung einer Boolschen NOR Gatters kombiniert, was zu einer 30-fachen Regulation führte.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 03 Apr 2019 11:09
Last Modified: 03 Apr 2019 11:09
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-85801
Referees: Suess, Pr Beatrix and Alexander, Pr Loewer
Refereed: 25 October 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8580
Export:
Actions (login required)
View Item View Item