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Die Sortierung von Membranproteinen: Der Einfluss der codon usage auf die Sortierung von Modell-Kaliumkanälen

Kithil, Marina (2019):
Die Sortierung von Membranproteinen: Der Einfluss der codon usage auf die Sortierung von Modell-Kaliumkanälen.
Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

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Dissertation_Marina_Kithil_2018.pdf - Accepted Version
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Die Sortierung von Membranproteinen: Der Einfluss der codon usage auf die Sortierung von Modell-Kaliumkanälen
Language: German
Abstract:

Manche Membranproteine, zu denen auch einige Ionenkanäle gehören, können einer sogenannten Dualen Sortierung (dual targeting) unterliegen. Dieses Phänomen beschreibt einen zellulären Sortierungsprozess, bei dem Isoproteine oder auch ein und das selbe Translations-Produkt in verschiedene Zielmembranen, wie z. B. der Plasmamembran, dem ER und den Mitochondrien inseriert werden können. Vor dem Hintergrund der sehr unterschiedlichen Sortierungsmechanismen von Proteinen zur Plasmamembran (cotranslationales targeting) oder in die Mitochondrien (posttranslationales targeting) ist der genaue Mechanismus, der dem dualen targeting von Membranproteinen zu Grunde liegt, noch nicht vollkommen verstanden. Neuere Untersuchungen, die auf einen Zusammenhang zwischen der Codonzusammensetzung eines Gens und der Geschwindigkeit der Synthese des Genproduktes hinweisen, lassen vermuten, dass auch die Kinetik der Proteinsynthese entscheidend für die Sortierung eines naszierenden Proteins sein könnte. Hier wird der Einfluss der codon usage auf die Sortierung von Membranproteinen untersucht. Unter codon usage versteht man das Phänomen, dass die möglichen Varianten des genetischen Codes in einem Organismus unterschiedlich häufig verwendet werden wobei häufig benutzte Codons die Proteinsynthese beschleunigen und Seltene diesen Vorgang verlangsamen. Um den Einfluss der codon usage auf die Proteinsortierung zu untersuchen, wurden hier zwei homologe virale Kaliumkanäle als Modellsystem genutzt. Die Kanäle Kesv aus dem Ectocarpus siliculosus Virus 1 und KcvPBCV-1 aus dem Paramecium Bursaria Chlorella Virus 1 sind strukturell im hohen Maße ähnlich, unterliegen jedoch nach heterologer Expression in HEK293-Zellen einer komplett unterschiedlichen Sortierung. So ist Kesv vor allem in den Mitochondrien lokalisiert, während Kcv über den sekretorischen Weg an die Plasmamembran sortiert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Sortierung von Kesv und Kcv als Fusionsproteine mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) nach heterologer Expression in HEK293 Zellen quantitativ mit Hilfe der Konfokalmikroskopie untersucht. Dadurch sollte die Sortierungspräferenz der Kanalproteine als Funktion der Codonzusammensetzung in den entsprechenden Genen untersucht werden. Dabei konnte für Kesv festgestellt werden, dass der Kanal zwar in der Mehrzahl der Zellen mitochondrial sortiert vorliegt, in einem geringen Anteil (<10 %) der Zellen jedoch auch im ER anzutreffen ist. Eine gezielte Codonoptimierung von Kesv, bei der in einem synthetischen Gen seltene Codone durch häufige ersetzt wurden, führte zu einer effizienten Sortierung in die Mitochondrien; in diesem Fall war der Kanal nicht nur in HEK293 Zellen, sondern unabhängig vom untersuchten Zelltyp (COS-7, HeLa, HaCaT, A549) ausschließlich in den Mitochondrien zu finden. Die entgegengesetzte Manipulation bei der in einem synthetischen Gen vorwiegend seltene Codone genutzt wurden, führt zu einer verminderten Sortierung in die Mitochondrien, sowie zu einer gleichzeitig zunehmenden Fehlsortierung und einem folgenden Abbau des Kanalproteins. Die Daten zeigen erstmalig, dass ein Protein mit unveränderter Aminosäuresequenz in Abhängigkeit von der Codonstruktur des Gens unterschiedlich in Zellen sortiert wird. Dieser Prozess ist proteinspezifisch, da die gleichen Änderungen in der Codonfrequenz von Kcv keinen Einfluss auf dessen Sortierung haben. Um die Frage zu beantworten, ob es in dem Kesv Gen Bereiche gibt, die besonders kritisch bezüglich ihrer Codonzusammensetzung für die Sortierung des Proteins sind, wurden Chimären aus dem wt Gen und dem codonoptimierten Gen hergestellt; in synthetischen Genen wurden dazu unterschiedliche Bereiche des wt Gens codonoptimiert. Die Analyse der GFP markierten Genprodukte in HEK293 Zellen zeigt, dass eine partielle Codonoptimierung unterschiedliche Sortierungsphänotypen hervorbring. Je nach Position des codonoptimierten Genbereiches wurde der Kanal i) ausschließlich in die Mitochondrien sortiert, ii) vermehrt ins ER umgeleitet oder iii) fehlsortiert. In besonderen Fällen wurden auch Zellen beobachtet in denen der Kanal in der gleichen Zelle in beiden Kompartimenten, den Mitochondrien und dem ER, lokalisiert war. Die Untersuchung der Sortierungsphänotypen in Abhängigkeit von der Position im Gen, an der die Codone optimiert wurden, ergeben keinen klaren Hinweis auf einen kritischen Bereich im Gen, der über die Sortierung des Genproduktes entscheidet. Auf Basis der vorliegenden Ergebnisse kann man lediglich spekulieren, dass eine Abfolge von Bereichen mit häufigen und seltenen Codonen für die Sortierung kritisch ist. Die erhobenen Daten zeigen erstmalig, dass duales targeting eines Membranproteins durch die Codonstruktur des Gens gesteuert werden kann. Es kann spekuliert werden, dass ein solcher Mechanismus, der bei einem Modellprotein auftritt, auch unter physiologischen Bedingungen relevant ist. Die Interpretation dieses Phänomens im Zusammenhang mit einer unterschiedlichen Geschwindigkeit der Proteinsynthese, wird durch die hier gezeigten Experimente unterstützt. Diese legen dar, dass die vermehrte Sortierung des Kesv Kanals in die Mitochondrien nach Codonoptimierung durch niedrige Temperaturen bei der Kultivierung der Zellen wieder aufgehoben werden kann. Diese Daten lassen damit den Schluss zu, dass die Translationsgeschwindigkeit mit über den Sortierungsweg eines Proteins entscheidet. Die Ergebnisse zeigen jedoch auch, dass diese Sortierung nicht alleine durch die Codonfrequenz des Gens bestimmt wird, sondern, dass dies nur in Kombination mit einem noch nicht definierten Zustand der einzelnen Zelle geschieht. So findet man in der gleichen Präparation das Genprodukt von einem teilweise codonoptimierten Gen entweder im ER oder in den Mitochondrien. Die Frage, warum eine Zelle das gleiche Genprodukt in die Mitochondrien sortiert, während es in der anderen Zelle in den sekretorischen Weg gelangt, kann hier nicht vollständig beantwortet werden. Die Daten deuten jedoch darauf hin, dass der Ernährungszustand einer Zelle für diese Sortierungsphänomene nicht verantwortlich ist. Zwar besteht eine tendenzielle Abhängigkeit der Sortierung von Zellzyklusphasen, jedoch scheint die Zellzyklusphase nicht ausschließlich das Sortierungsschicksal des Genprodukts zu bestimmen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Some membrane proteins, including ion channels, are subject to dual targeting. This phenomenon describes a cellular sorting process in which isoproteins or the same translational product can be inserted into different target membranes such as the plasma membrane, the ER and the mitochondria. Against the background of the very different sorting mechanisms of proteins to the plasma membrane (cotranslational targeting) or into the mitochondria (posttranslational targeting), the exact mechanism underlying the dual targeting of membrane proteins is not yet fully understood. Recent investigations, which indicate a correlation between the codon composition of a gene and the speed of synthesis of the gene product, suggest that the kinetics of protein synthesis could also be decisive for the sorting of a nascent protein. Here, the influence of codon usage on the sorting of membrane proteins is investigated. The term codon usage refers to the phenomenon that possible variants of the genetic code in an organism are used with varying frequency. Frequently used codons accelerate protein synthesis while rare codons slow this process down. In order to investigate the influence of codon usage on protein sorting, two homologous viral potassium channels were used as model systems. The channels Kesv from Ectocarpus siliculosus Virus 1 and KcvPBCV-1 from Paramecium Bursaria Chlorella Virus 1 are structurally very similar, but are subject to completely different sorting after heterologous expression in HEK293 cells. Kesv is located mainly in the mitochondria, while Kcv is sorted via the secretory path to the plasma membrane. In the present work, the sorting of Kesv and Kcv as fusion proteins with the green fluorescent protein (GFP) after heterologous expression in HEK293 cells was quantitatively investigated using confocal laser scanning microscopy. The aim was to investigate the sorting preference of the channel proteins as a function of the codon composition in the corresponding genes. For Kesv, it was found that although in the majority of cells the channel is present in the mitochondria, in a small proportion (<10 %) of the cells Kesv is also found in the ER. A targeted codon optimization of Kesv, in which rare codons in a synthetic gene were replaced by frequent ones, led to an efficient sorting into the mitochondria; in this case the channel was not only found in HEK293 cells, but independent of the investigated cell type (COS-7, HeLa, HaCaT, A549) exclusively in the mitochondria. The opposite manipulation, in which predominantly rare codons were used in a synthetic gene, leads to a reduced sorting into the mitochondria, as well as to a simultaneously increasing sorting error and a subsequent degradation of the channel protein. The data show for the first time that a protein with the same amino acid sequence is sorted differently in cells depending on the codon structure of the gene. This process is protein-specific, since the same changes in the codon frequency of Kcv have no influence on its sorting. To answer the question whether there are areas in the Kesv gene that are particularly critical with regard to their codon composition for the sorting of the protein, chimeras were produced from the wt gene and the codon-optimized gene; in synthetic genes different areas of the wt gene were codon-optimized for this purpose. The analysis of GFP labelled gene products in HEK293 cells shows that partial codon optimization produces different sorting phenotypes. Depending on the position of the codon-optimized gene region, the channel was i) sorted exclusively into the mitochondria, ii) increasingly redirected into the ER or iii) mis-sorted. In special cases, cells were observed in which the channel was located in the same cell in both compartments, mitochondria and ER. The investigation of the sorting phenotypes depending on the position in the gene at which the codons were optimized does not provide a clear indication of a critical region in the gene that determines the sorting of the gene product. On the basis of the available results one can only speculate that a sequence of areas with frequent and rare codons is critical for sorting. The collected data show for the first time that dual targeting of a membrane protein can be controlled by the codon structure of the gene. It can be speculated that such a mechanism, which occurs in a model protein, is also relevant under physiological conditions. The interpretation of this phenomenon in connection with a different speed of protein synthesis is supported by the experiments shown here. These experiments show that the increased sorting of the Kesv channel into the mitochondria after codon optimization can be reversed by low temperatures during cell cultivation. These data allow the conclusion to be drawn that the speed of translation also determines the sorting pathway of a protein. However, the results also show that this sorting is not solely determined by the codon frequency of the gene, but that this occurs in combination with a not yet defined state of the individual cell. In the same preparation, the gene product of a partially codon-optimised gene can be found either in the ER or in the mitochondria. The question of why one cell sorts the same gene product into the mitochondria while the other cell sorts it into the secretory pathway cannot be answered completely here. However, the data suggest that the nutritional status of a cell is not responsible for these sorting phenomena. Although there is a tendency for sorting to depend on cell cycle phases, the cell cycle phase does not seem to exclusively determine the sorting fate of the gene product.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Plant Membrane Biophysics
Date Deposited: 31 Jan 2019 12:02
Last Modified: 09 Jul 2020 02:28
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-83508
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed: 17 December 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8350
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