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In Silico Studies on Proteins for Synthetic Biology

Groß, Christine (2019):
In Silico Studies on Proteins for Synthetic Biology.
Darmstadt, Technische Universität,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: In Silico Studies on Proteins for Synthetic Biology
Language: English
Abstract:

Synthetic biology develops artificial biomolecules or biological systems with novel functionalities for diverse applications in research, medicine or industry. This thesis focuses on in silico studies of three proteins that are promising candidates for enzymatic plastic waste treatment and highly sensitive biosensors, respectively. The first candidate is the enzyme Fusarium solani Cutinase (Longhi and Cambillau 1999), which is able to degrade synthetic polymers, like PET. It allows for the development of an environmental friendly and sustainable solution for plastic waste treatment on an industrial scale. As the wildype enzyme loses its activity during the process of PET degradation, a rational design approach was followed, to improve the activity of this enzyme for PET as substrate. Via MD simulations and linear response theory (LRT) (Ikeguchi et al. 2005) based on coarse-grained elastic network models, the reason for the loss of activity could be identified. Based on the knownledge gained, mutants with improved activity for PET were proposed. In the context of this study, an extension for the LRT method similar to that of a previous study (Knorr 2015) was developed. The second protein system, the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation (HCN) channel (Santoro and Tibbs 1999), regulates the flux of ions across biological membranes by changes in the membrane voltage and binding of the ligand cAMP. Hence, it is an ideal model for studying the interplay of different domains during the gating process. Together with plenty of other ion channels, it can also serve as building blocks for the assembly of different domains to design synthetic ion channels with novel functionalities. To understand the complex mechanism of HCN gating, the extension of the LRT method was adjusted to work for a tetramer and was used to determine the conformational changes that occur upon binding of the ligand cAMP. In this context, movements in the transmembrane domains that are involved in the gating process were discovered for the first time. They provide important information on the complex gating mechanism and enable a directed planning of further experimental and theoretical investigations. Small viral pore forming proteins also enable the flux of ions across biological membranes and therefore can be seen as viral companions of ion channels. The third protein is such a pore forming protein from HIV and simian relatives SIV, called Vpu (Cohen et al. 1988). As this small protein is less complex than ion channels but also exhibits ion channel function, it is another candidate to serve as building block for the design of artificial ion channels. To consider the Vpu protein as possible building block, the formation of an ion conducting pore has to be a reliable property. In this thesis, the evolutionary conservation of ion channel formation was proved by computing the Shannon entropy (Strait and Dewey 1996) for involved residues based on a multiple sequence alignment. Although the study could not clarify the role of the ion channel function for virus release or replication, the detected evolutionary conservation serves as proof for the functional significance. Hence, this protein reliably forms an ion conducting pore and can be further considered as possible building block for the assembly of synthetic ion channels.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die synthetische Biologie entwickelt artifizielle Biomoleküle oder ganze biologische Systeme mit neuartigen Funktionen für Anwendungen in der Forschung, Medizin oder Industrie. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf in silico Studien dreier Proteine, die vielverprechende Kandidaten für die enzymatische Verwertung von Plastikmüll bzw. hochsensitive Biosensoren darstellen. Der erste Kandidat ist das Enzym Fusarium solani Cutinase (Longhi and Cambillau 1999), welches in der Lage ist, synthetische Polymere, wie PET, abzubauen. Es ermöglicht daher die Etablierung einer umweltfreundlichen und nachhaltigen Lösung zum Abbau von Plastikmüll in einem industriellen Maßstab. Da das Wildtyp Enzym während des Abbaus von PET an Aktivität verliert, wurde ein rationaler Design Ansatz verfolgt, um die Aktivität des Enzyms gegenüber PET als Substrat zu verbessern. Mittels MD Simulationen und der Linear Response Theory (LRT) (Ikeguchi et al. 2005) basierend auf reduzierten elastischen Netzwerkmodellen konnte die Ursache für den Aktivitätsverlust identifiziert werden. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wurden Mutanten mit einer erhöhten Aktivität gegenüber PET vorgeschlagen. Im Rahmen dieser Studie wurde für die LRT Methode eine Erweiterung ähnlich der aus einer früheren Studie (Knorr 2015) entwickelt. Das zweite Proteinsystem, der hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) Kanal (Santoro and Tibbs 1999), reguliert den Ionenfluss durch biologische Membranen basierend auf Änderungen der Membranspannung sowie durch Binden des Liganden cAMP. Dieser Ionenkanal ist ein ideales Modell, um das Zusammenspiel verschiedener Domänen während des Schaltvorgangs zu untersuchen. Desweiteren bildet er mit einer Vielzahl anderer Ionenkanäle eine Art Baukasten, sodass nach dem Baukastenprinzip verschiedene Domänen zu einem synthetischen Ionenkanal mit neuartigen Eigenschaften zusammengesetzt werden können. Um den komplexen Schaltmechanismus des HCN Kanals zu verstehen, wurde die für ein Monomer implementierte Erweiterung der LRT Methode an Tetramere angepasst und verwendet, um die resultierenden Konformationsänderungen nach Binden des Liganden cAMP zu bestimmen. In diesem Zusammenhang wurden erstmals Bewegungen in den transmembranen Bereichen beobachtet, die am Kanalschalten beteiligt sind. Diese liefern wichtige Hinweise zum mechanistischen Ablauf des komplexen Kanalschaltens und ermöglichen die gezielte Planung weiterer experimenteller und theoretischer Untersuchungen. Kleine virale porenbildende Proteine ermöglichen ebenfalls den Fluss von Ionen durch biologische Membranen und können daher als virale Pendants zu Ionenkanälen betrachtet werden. Das dritte Protein ist solch ein porenbildendes Protein von HIV und seinem affenartigen Verwandten SIV und wird als Vpu Protein (Cohen et al. 1988) bezeichnet. Da dieses kleine Protein weniger komplex ist als Ionenkanäle aber ebenfalls eine Ionenkanalaktivität aufweist, ist es ein weiterer Kandidat zur Erweiterung des Baukastens für die Entwicklung artifizieller Ionenkanäle. Um das Vpu Protein als möglichen Baustein in Betracht zu ziehen, muss das Bilden der ionenleitenden Pore eine zuverlässige Eigenschaft sein. In dieser Arbeit wurde die evolutionäre Konserviertheit der Ionenkanalbildung durch Berechnung der Shannon entropy (Strait and Dewey 1996) für betroffene Residuen basierend auf einem multiplen Sequenzalignment nachgewiesen. Obwohl die Studie nicht aufklären konnte, welche Rolle die Funktion als Ionenkanal für die Virusfreisetzung und Replikation spielt, kann die evolutionäre Konserviertheit als Beweis für eine funktionale Signifikanz gedeutet werden. Somit bildet das Vpu Protein zuverlässig ionenleitende Poren und kann weiterhin als möglicher Baustein für den Zusammenbau synthetischer Ionenkanäle berücksichtigt werden.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Computational Biology and Simulation
Date Deposited: 29 Jan 2019 09:28
Last Modified: 09 Jul 2020 02:28
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-83488
Referees: Hamacher, Prof. Dr. Kay and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 13 December 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8348
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