TU Darmstadt / ULB / TUprints

Development of photo-responsive synthetic RNA devices

Lotz, Thea Sabrina (2018):
Development of photo-responsive synthetic RNA devices.
Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

[img]
Preview
Text
Dissertation_Lotz_Unterschrieben.pdf
Available under CC-BY-NC-SA 4.0 International - Creative Commons, Attribution Non-commercial, Share-alike.

Download (4MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Development of photo-responsive synthetic RNA devices
Language: English
Abstract:

The different functions of RNA have led to great and increasing interest in the field of synthetic biology. One such example of versatile RNA molecules used in synthetic biology is aptamers. Aptamers are able to bind to a wide range of target molecules with a high affinity and specificity, which is why they are often compared to antibodies. Using the SELEX method, they can be generated in vitro against target molecules for a broad range of possible applications. In nature, they work as the sensing domain of riboswitches and regulate gene expression by binding their cognate target molecule. Riboswitches can also be generated synthetically from in vitro generated aptamers. In the course of this work, a novel RNA aptamer which selectively binds to one of two light-induced isoforms of a specific small molecule ligand (azoCm) was developed. The potential function of such an aptamer as a riboswitch was evaluated. A previously carried out SELEX experiment against azoCm yielded a specifically binding aptamer (aptamer 42). At the beginning of this work, its secondary structure was analyzed using in-line probing. As it was previously shown aptamer 42 could not work as a riboswitch regulating GFP expression in the model organisms Saccharomyces cerevisiae, other aptamers from the same SELEX were tested under the same conditions using in vivo screening. As no functional riboswitch could be identified, a new SELEX experiment using a new aptamer library was started. The new affinity SELEX yielded aptamers specifically binding to azoCm. However, in vivo screening of aptamers from this SELEX did not result in an azoCm dependent riboswitch. Therefore, a novel light SELEX method was developed and established. This light SELEX protocol enriched isoform selective aptamers by a light-induced conformational change of azoCm during the SELEX process. As in vivo screening of light SELEX aptamers did not yield a riboswitch again, in vitro binding studies of aptamers from the light SELEX were performed. Comparing three aptamers which showed the highest discrimination between the two isoforms of azoCm to each other led to the discovery of a 13 nt sequence motif that only these aptamers shared. A next-generation sequencing experiment performed with the SELEX and light SELEX rounds revealed that this sequence motif (“light motif”) was specifically enriched during light SELEX rounds, but was gradually depleted during the later, more stringent affinity SELEX. Based on this discovery, a new library for SELEX was designed, containing the partially randomized light motif, as well as entirely randomized flanking regions. SELEX performed with this light motif doped library led to a fast enrichment within five rounds, and aptamers from this SELEX were tested regarding their in vivo functionality. From the aptamers tested in vivo, four showed gene regulatory function, however with a low regulatory factor of 1.25- to 1.35-fold. Based on the best functional aptamer B2, partially randomized aptamer libraries were generated for further in vivo screenings. While the regulatory factor of B2 could not be improved using this approach, a modified version of it called B2-1 could be shown to regulate gene expression in yeast cells in an azoCm dose-dependent manner. To learn more about the aptamer B2-1, its binding affinity was analyzed using isothermal calorimetry. The kD of B2-1 was determined to be 23 nM, depending on the calculation model used. A truncated version of B2-1 showed a low micromolar binding to azoCm, indicating that structurally relevant parts of B2-1 had been deleted during the truncation. However, both B2-1 and its truncated version did selectively bind to only one isoform of azoCm, while binding to the other isoform could not be detected. The aptamer developed in this work shows a much stronger discrimination between the two isoforms of its light-switchable ligand than previously reported isoform-selective aptamers. It also shows the highest binding affinity to its ligand compared to the isoform-selective aptamers in literature to date. While a riboswitch based on this aptamer shows only slight regulatory function, dose dependent regulation of gene expression could be shown. This work therefore constitutes the first steps towards the generation of a light dependent riboswitch.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die verschiedenen Funktionen von RNA haben zu einem großen und zunehmenden Interesse für das Feld der synthetischen Biologie geführt. Ein Beispiel für vielseitige RNA-Moleküle in der synthetischen Biologie sind Aptamere. Aptamere sind in der Lage, an ein breites Spektrum von Zielmolekülen mit hoher Affinität und Spezifität zu binden, weshalb sie oft mit Antikörpern verglichen werden. Mit der SELEX-Methode können Aptamere für bestimmte Zielmoleküle in vitro für ein breites Anwendungsspektrum generiert werden. In der Natur fungieren sie als Sensordomäne von Riboswitchen und regulieren die Genexpression, indem sie an ihr Zielmolekül binden. Riboswitche können mittels synthetischer Biologie auch aus in vitro selektierten Aptameren erzeugt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuartiges RNA-Aptamer entwickelt, welches selektiv an eine von zwei lichtinduzierten Isoformen eines bestimmten niedermolekularen Liganden (azoCm) bindet. Die potenzielle Funktion eines solchen Aptamers als Riboswitch wurde untersucht. Ein zuvor durchgeführtes SELEX-Experiment gegen azoCm ergab ein spezifisch bindendes Aptamer (Aptamer 42). Zu Beginn dieser Arbeit wurde dessen Sekundärstruktur mit Hilfe von In-Line Probing analysiert. Wie vorhergehende Untersuchungen zeigten, besaß Aptamer 42 keine Riboswitch-Funktion zur Regulation der GFP-Expression im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae. Daher wurden andere Aptamere aus der gleichen SELEX unter gleichen Bedingungen mittels in vivo Screening getestet. Da kein funktionsfähiger Riboswitch identifiziert werden konnte, wurde ein neues SELEX-Experiment mit einer neuen Aptamer Bibliothek durchgeführt. Die neue SELEX ergab Aptamere, die spezifisch an azoCm binden. Das in vivo Screening von Aptameren aus dieser SELEX führte jedoch nicht zu einem funktionsfähigen azoCm abhängigen Riboswitch. Darum wurde eine neuartige Licht-SELEX Methode entwickelt und durchgeführt. Aptamere aus dieser Licht-SELEX wurden durch eine lichtinduzierte Konformationsänderung von azoCm während des SELEX-Prozesses erzeugt. Dies führte zu einer Anreicherung von Isoform-selektiven Aptameren. Da in vivo Screening der Aptamere aus der Licht-SELEX wiederum keine Riboswitch-Funktion zeigte, wurden in vitro Bindungsstudien durchgeführt. Der Vergleich von drei Aptameren, die die unterschiedlichste Bindungsspezifität zwischen den beiden Isoformen von azoCm zeigten, führte zur Entdeckung eines 13 nt Sequenzmotivs, das nur diesen Aptameren gemeinsam war. Next Generation Sequencing der SELEX und Licht-SELEX Runden ergab, dass dieses Sequenzmotiv ("Lichtmotiv") während der Licht-SELEX Runden spezifisch angereichert wurde, während es sich in den Runden der klassischen SELEX mit hoher Stringenz stufenweise verringerte. Basierend auf dieser Entdeckung wurde eine neue Aptamer Bibliothek für SELEX entworfen, die sowohl das teilweise randomisierte Lichtmotiv als auch vollständig randomisierte Randbereiche enthielt. Eine SELEX mit dieser das Lichtmotiv enthaltenden Bibliothek führte zu einer schnellen Anreicherung innerhalb von fünf Runden. Aptamere aus dieser SELEX wurden auf ihre in vivo Funktionalität getestet. Von den getesteten Aptameren zeigten vier eine genregulatorische Funktion in S. cerevisiae, allerdings mit einem niedrigen Regulationsfaktor von 1,25- bis 1,35-fach. Basierend auf dem am stärksten regulierenden Aptamer B2 wurden teilweise randomisierte Aptamer-Bibliotheken für weitere in vivo Screenings generiert. Während der regulatorische Faktor von B2 mit diesem Ansatz nicht verbessert werden konnte, konnte eine modifizierte Version namens B2-1 entwickelt werden, die die Genexpression in S. cerevisiae dosisabhängig reguliert. Um mehr über das Aptamer B2-1 zu erfahren, wurde seine Bindungsaffinität mittels Isothermer Titrationskalorimetrie analysiert. Die Dissoziationskonstante von B2-1 lag im niedrigen nanomolaren Bereich (23 nM). Eine verkürzte Version von B2-1 zeigte eine niedrige mikromolare Bindung an azoCm, was darauf hindeutete, dass strukturell relevante Teile von B2-1 während der Verkürzung wegfielen. Sowohl B2-1 als auch seine verkürzte Version banden jedoch selektiv nur an eine Isoform von azoCm, während eine Bindung an die andere Isoform nicht festgestellt werden konnte. Das in dieser Arbeit entwickelte Aptamer zeigt eine viel stärkere Diskriminierung zwischen den beiden Isoformen seines lichtschaltbaren Liganden als andere bisher publizierte Isoform-selektive Aptamere. Es zeigt auch die höchste Bindungsaffinität zu seinem Liganden als Isoform-selektive Aptameren in der bisherigen Literatur. Während ein auf diesem Aptamer basierender Riboswitch nur eine geringe regulatorische Funktion aufweist, konnte eine dosisabhängige Regulation der Genexpression nachgewiesen werden. Diese Arbeit beinhaltet daher die ersten Schritte zur Erzeugung eines lichtabhängigen Riboswitches.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 07 Feb 2019 14:41
Last Modified: 09 Jul 2020 02:27
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-82842
Referees: Süß, Professor Beatrix and Pfeifer, Professor Felicitas
Refereed: 29 October 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8284
Export:
Actions (login required)
View Item View Item