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PRMT6 als mögliches Ziel einer Therapie und seine Wirkung in der Hämatopoese

Herkt, Stefanie Carolin (2019):
PRMT6 als mögliches Ziel einer Therapie und seine Wirkung in der Hämatopoese.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00008166,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: PRMT6 als mögliches Ziel einer Therapie und seine Wirkung in der Hämatopoese
Language: German
Abstract:

Die adulte Hämatopoese ist ein hierarchisch organisierter Prozess, der durch die Differenzie-rung von pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) zu jeglichen Zellen des Blutes gekennzeichnet ist. Während der Differenzierung kommt es zu einer Reihe von Linien-Entscheidungen, die durch extrinsische Faktoren, wie extrazelluläre Signale, Zytokine und Zell-Zell-Interaktionen oder durch intrinsische Faktoren, wie Transkriptionsfaktoren gesteuert werden (Barreda & Belosevic, 2001; Cantor & Orkin, 2001; Cantor & Orkin, 2002; Goode et al, 2016; Orkin, 2000; Orkin & Zon, 2008). Das Zusammenspiel der Transkriptionsfaktoren mit epigenetischen Kofaktoren ist wichtig für die hämatopoetische Genexpressionskontrolle und entscheidend für die Liniendifferenzierung (Goldberg et al, 2007; Li, 2002). Linienent-scheidungen werden an Verzweigungspunkten der Diffrenzierung getroffen, an denen Transkriptionsfaktoren zelltypspezifische Genexpressionsprogramme initiieren können. Der Transkriptionsfaktor RUNX1 (runt related transcription factor 1) ist ein wichtiger Regulator der hämatopoetischen Differenzierung. Dies wird dadurch verdeutlicht, dass Mutationen oder eine aberrante Expression des RUNX1-Gens zu Defekten in der Hämatopoese und letzlich zu einer Leukämie oder zu einer beeinflussten megakaryozytären Differenzierung führen können (Ichikawa et al, 2004; Sood et al, 2017). RUNX1 bindet an die DNA seiner Zielgene und aktiviert oder reprimiert durch seine Assoziation mit anderen Transkriptionsfaktoren oder Kofaktoren die Genexpression (Durst & Hiebert, 2004; Yamagata et al, 2005). Das bedeutet die Wirkung von RUNX1 auf die Transkription von Differenzierungsgenen ist von seinen Ko-faktoren abhängig (Lausen, 2013). Die Protein-Argininmethyltransferase 6 (PRMT6) ist ein wichtiger Korepressor, der mit RUNX1 assoziiert ist (Herglotz et al, 2013; Herkt et al, 2017; Kuvardina et al, 2015). PRMT6 ist ein epigenetisches Enzym, welches hauptsächlich für die Etablierung der Dimethylierung von Histon 3 am Arginin-Rest 2 (H3R2me2) bekannt ist, was zu einer Repression der Transkription führt (Guccione et al, 2007; Hyllus et al, 2007; Iberg et al, 2008). Zusätzlich ist PRMT6 in verschiedenen Tumorentitäten überexprimert und wirkt wie ein Onkogen in Brustkrebs durch die Förderung des Tumorwachstums (Phalke et al, 2012; Yoshimatsu et al, 2011). Bis jetzt konnte jedoch noch keine Verbindung zur Leukämie gezeigt werden. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Wirkung von PRMT6 in der hämatopoetischen Differenzierung und seine potentielle Rolle in der akuten myeloischen Leukämie (AML) untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein lentiviraler Knockdown von PRMT6 einen negativen Ef-fekt auf das Wachstum einer Leukämie-Zelllinie, als auch einen inhibierenden Effekt auf das Tumorwachstum in einem Xenograft-Mausmodell hat. Um zu überprüfen, ob PRMT6 mit der Progression einer AML assoziiert sein könnte, wurde die Proteinexpression von PRMT6 in Patienten-Proben untersucht. Dabei konnte eine erhöhte Expression von PRMT6 in Patienten mit akuter myeloischer Leukämie gefunden werden. Da RUNX1 in der Lage ist PRMT6 zu seinen Zielgenen zu rekrutieren und ebenso mit der Progression einer AML assoziiert ist, sollten gemeinsame Zielgene gefunden werden. Dabei wurden Gene identifiziert, die in der Apoptose, der Zellzykluskontrolle und dem Zellwachstum involviert sind. Eines dieser Gene ist CDKN1B, welches ein wichtiger Zellzyklus-Regulator darstellt. Dieses Gen wurde als ge-meinsames Zielgen von RUNX1 und PRMT6 durch eine Chromatin-Immunopräzipitation ve-rifiziert. Da eine Herrunterregulation von PRMT6 mittels Knockdown das Zellwachstum ver-mindert, könnte eine Inhibition von PRMT6 durch small molecules eine mögliche epigeneti-sche Therapie darstellen. Ähnliche Therapien durch Inhibitoren gegen Histon-Deacetyltrasnferasen (HDACi) wurden schon erfolgreich eingesetzt (Marks & Xu, 2009). Aus diesem Grund wurden neue small molecule-Inhibitoren für PRMT6 getestet, die das Zell-wachstum und die Genexpression von CDKN1B beeinflussen konnten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass PRMT6 ein potentielles neues Ziel für eine epigenetische Leukämie-Therapie darstellt. Da RUNX1 ebenfalls eine Rolle in der normalen Differenzierung spielt, insbesondere in der erythroiden/megakaryozytären Entwicklung und außerdem mit PRMT6 interagieren kann, wurde die Rolle von PRMT6 in der Differenzierung näher untersucht. In dieser Dissertation konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass PRMT6 das erythroide Genexpressionspro-gramm während der megakaryozytären Entwicklung von primären CD34+-Vorläuferzellen inhibiert. Durch eine Herunterregulation von PRMT6 wurde eine Erhöhung der Expression von verschiedenen erythroiden Genen, wie Glykophorin A, ALAS2, AHSP, KLF1 und ß Globin erreicht werden. PRMT6 wird zu erythroiden Genen, wie Glykophorin A während der Megakayopoiese rekrutiert und etabliert ein repressives Histon-Modifikationsmuster. H3R2me2 nimmt an dem Promotor zu, während die aktive Histonmodifikation H3K4me3 ab-nimmt. Eine Manipulation von PRMT6 durch Überexpression oder Knockdown konnte au-ßerdem die Differenzierung von CD34+-Zellen entweder in die megakaryozytäre oder eryth-roide Richtung begünstigen. Außerdem konnte eine Inhibition von PRMT6 durch small molecules zu einer Erhöhung der Expression von erythroiden Genen und schließlich zu einer verstärkten Erythropoese führen. Diese Ergebnisse zeigen, dass PRMT6 eine Rolle in der Kontrolle der erythroiden/megakaryozytären Differenzierung inne hat. Dies eröffnet die Mög-lichkeit einer Manipulierung der PRMT6-Aktivität, um eine verstärkte Erythropese für thera-peutische Zwecke zu erreichen.

Die Ergebnisse in Kapitel 3 wurden teilweise in der Zeitschrift „haematologica“ mit dem Titel „Protein arginine methyltransferase 6 controls erythroid gene expression and differentiation of human CD34+ progenitor cells“ (2017) veröffentlicht. Der Autor dieser Dissertation ist ebenfalls der Autor des veröffentlichten Manuskripts.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Adult hematopoiesis is orchestrated by a series of lineage fate decisions that ensure the dif-ferentiation of all mature blood cell types from pluripotent hematopoietic stem cells (HSCs). This process is guided by extrinsic factors, such as extracellular signals, cytokines and cell-cell-interactions or intrinsic factors, like transcription factors (Barreda & Belosevic, 2001; Cantor & Orkin, 2001; Cantor & Orkin, 2002; Goode et al, 2016; Orkin, 2000; Orkin & Zon, 2008). The interplay between transcription factors and epigenetic cofactors is important for hematopoietic gene expression control and decisive for lineage specification (Goldberg et al, 2007; Li, 2002). Lineage decisions are made at bipotential branching points where key tran-scription factors initiate cell type-specific gene expression programs. The transcription factor RUNX1 (runt related transcription factor 1) is considered as an important regulator of hema-topoietic differentiation, as mutations or an aberrant expression of the RUNX1 gene can cause defects in hematopoiesis, leading to acute myeloid leukemia (AML) or impaired megakaryocytic differentiation (Ichikawa et al, 2004; Sood et al, 2017). RUNX1 plays a key role at different stages, activating or repressing transcriptional targets through its DNA binding in association with other transcription factors or cofactors (Durst & Hiebert, 2004; Yamagata et al, 2005). This means the effect of RUNX1 on the expression of differentiation genes is dependent on its cofactors (Lausen, 2013). The protein arginine methyltransferase 6 (PRMT6) is an important corepressor associated with RUNX1 (Herglotz et al, 2013; Herkt et al, 2017; Kuvardina et al, 2015). PRMT6 is an epigenetic enzyme known for the estab-lishment of the dimethylation of histone 3 at the arginine-residue 2 (H3R2me2), which results in the repression of the transcription at its target genes (Guccione et al, 2007; Hyllus et al, 2007; Iberg et al, 2008). In addition, PRMT6 is overexpressed in different tumor entities and functions as an oncogene in breast cancer by promoting the tumor growth (Phalke et al, 2012; Yoshimatsu et al, 2011). Until now, a connection to leukemia has not been reported. In this study, the function of PRMT6 in hematopoietic differentiation and its potential role in acute myeloid leukemia was investigated. Here, it was shown that the lentiviral knockdown of PRMT6 has an effect on the growth of leukemia cells in cell culture as well as in a xenograft mouse model. In order to connect these studies to human leukemia, the status of PRMT6 protein expression in patient samples was analyzed by immunostaining. It was revealed that PRMT6 is expressed in patients with acute myeloid leukemia (AML). Because RUNX1 can recruit PRMT6 to its target genes and is also associated with the progression of AML, common target genes were identified. Thereby target genes were identified which are involved in apoptosis, cell cycle regulation and cell growth. Out of those genes CDKN1B, an important cell cycle regulator, was verified as a common target gene from RUNX1 and PRMT6 in a chromatin immunoprecipitation assay. Because knockdown of PRMT6 inhibits cell growth, inhibition of PRMT6 represents a potential strategy for an epigenetic therapy, similar to HDAC inhibitor treatment. Thus, it was tested if novel small molecule inhibitors of PRMT6 influence cell growth and gene expression of CDKN1B. In summary, PRMT6 would be a potential new target for an epigenetic leukemia therapy. Because RUNX1 has also an effect on normal hematopoiesis, especially in the erythroid/megakaryocytic branching point and is known to interact with PRMT6, the effect of PRMT6 in the differentiation was investigated. In this dissertation, it was shown for the first time that PRMT6 inhibits erythroid gene expression during megakaryopoiesis of primary CD34+ progenitor cells. Through knockdown of PRMT6, the expression of several erythroid genes, such as glycophorin A, ALAS2, AHSP, KLF1 and β-globin is increased. In detail, PRMT6 is recruited to erythroid genes, such as glycophorin A, during megakaryopoiesis. Consequently, a repressive histone modification pattern with high H3R2me2 and low H3K4me3 is established. The manipulation of PRMT6 through lentiviral overexpression or knockdown could influence the differentiation of primary cells to the megakaryocytic or erythroid direction. Importantly, inhibition of PRMT6 by small molecule inhibitors leads to upregulation of erythroid genes and promotes erythropoiesis. The findings reveal that PRMT6 plays a role in the control of erythroid/megakaryocytic differentiation and open up the possibility that manipulation of PRMT6 activity could facilitate enhanced erythropoiesis for therapeutic use. The results in Chapter 3, in part, have been published in the Journal of the European Hema-tology Association in haematologica with the title “Protein arginine methyltransferase 6 con-trols erythroid gene expression and differentiation of human CD34+ progenitor cells” (2017). The dissertation author is the primary investigator and author of the manuscript.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Stem Cell and Developmental Biology
10 Department of Biology > Molecular Genetics
10 Department of Biology > Postranscriptional Gene Regulation and RNA Therapeutics
Date Deposited: 18 Dec 2019 10:10
Last Modified: 09 Jul 2020 02:24
DOI: 10.25534/tuprints-00008166
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-81660
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Löwer, Prof. Dr. Alexander
Refereed: 9 August 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8166
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