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Struktur und Funktion der Ethylbenzol Dehydrogenase, einer anaeroben Kohlenwasserstoff-Hydroxylase

Hagel, Corina :
Struktur und Funktion der Ethylbenzol Dehydrogenase, einer anaeroben Kohlenwasserstoff-Hydroxylase.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2007)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Struktur und Funktion der Ethylbenzol Dehydrogenase, einer anaeroben Kohlenwasserstoff-Hydroxylase
Language: German
Abstract:

Die Ethylbenzol Dehydrogenase ist das initiale Schlüsselenzym des anaeroben Ethylbenzol Abbauweges im dentrifizierenden Beta-Proteobakterium Aromatoleum aromaticum Stamm EbN1. Das Enzym ist ein Molybdänenzym und gehört zur DMSO-Reduktase Familie. Es katalysiert die Sauerstoff-unabhängige und stereospezifische Hydroxylierung von Ethylbenzol zu (S)-1-Phenylethanol. Hierbei handelt es sich um eine bisher einzigartige Reaktion, die anaerobe Oxidation eines aromatischen Kohlenwasserstoffes. Im nachfolgenden Ethylbenzol-Abbauweg wird (S)-1-Phenylethanol zu Acetophenon oxidiert, welches anschließend zu Benzoylacetat carboxyliert wird. Eine Aktivierung von Benzoylacetat zum korrespondierenden CoA-Thioester durch eine CoA-Ligase und eine thiolytische Spaltung von Benzoylacetyl-CoA führt abschließend zu einem zentralen Intermediat des anaeroben Aromaten-Metabolismus, Benzoyl-CoA und Acetyl-CoA. In der vorliegenden Arbeit wurde die Ethylbenzol Dehydrogenase kristallisiert und die Struktur des Enzyms aufgeklärt. Darüber hinaus wurden die redoxaktiven Kofaktoren des Enzyms genauer charakterisiert und ihre Redoxpotentiale bestimmt. Über detaillierte Substrat- und Inhibitorstudien wurde ein erster Reaktionsmechanismus postuliert. Des weiteren wurde ein Vektor für die Klonierung der Gene der Ethylbenzol Dehydrogenase für zukünftige Mutationsstudien des rekombinanten Enzyms konstruiert. Abschließend wurde das Enzym Benzoylacetat-CoA Ligase rekombinant mit einem His-Tag in Escherichia coli überproduziert. Im Einzelnen wurden folgende Ergebnisse erhalten: Die Ethylbenzol Dehydrogenase ist ein periplasmatisches Enzym und besteht aus drei Untereinheiten, Alpha, Beta und Gamma. Das Enzym wurde anaerob kristallisiert und seine Struktur wurde bei einer Auflösung von 1,88 aufgeklärt. Die Architektur der Kofaktoren ist ähnlich zu denen der respiratorischen Nitratreduktase NarGHI von Escherichia coli. In der Alpha-Untereinheit befindet sich das katalytische Zentrum mit einem Molybdän, welches von zwei Molybdopterin-Guanin Dinukleotiden ligandiert wird, von denen einer einen offenen Pyranring besitzt. Die Elektronen werden über fünf Eisen-Schwefel-Zentren (FS0-FS4) transportiert, von welchen sich eines (FS0) in der Alpha-Untereinheit und die anderen (FS1-FS4) in der Beta Untereinheit befinden. Das Fe-S-Zentrum (FS0), welches dem aktiven Zentrum am Nächsten liegt, besitzt einen ungewöhnlichen Histidin-Liganden. Terminaler Elektronenakteptor ist ein Häm b-Kofaktor, welcher sich in der Gamma-Untereinheit befindet. Hierbei handelt es sich um den ersten Häm-Kofaktor, welcher Methionin und Lysin als axiale Liganden besitzt. Aufgrund von Untersuchungen des Substrat- und Inhibitorspektrums und das detaillierte Studium von Inhibitionskinetiken neuer und bereits bekannter Inhibitoren der Ethylbenzol Dehydrogenase wurden neue Erkenntnisse zum Reaktionsmechanismus des Enzyms gewonnen. Die Ethylbenzol Dehydrogenase ist ein Enzym, welches über ein sehr großes Spektrum von ca. 20 Substraten bzw. ca. 22 Inhibitoren verfügt. Unter den Inhibitoren befinden sich sowohl gemischte, als auch kompetitive Inhibitoren, welche eine sehr starke Affinität zum aktiven Zentrum des Enzyms aufweisen. Die Kofaktoren der Ethylbenzol Dehydrogenase wurden über UV-Vis- und Elektronenspinresonanz-Spektroskopie genauer analysiert. Dabei wurde die Anwesenheit eines [3Fe-4S]-, drei der vier [4Fe-4S]-Zentren, eines Molybdän- und eines Häm b-Kofaktors nachgewiesen. Zudem wurden die Redoxpotentiale der einzelnen Redoxzentren der Ethylbenzol Dehydrogenase bestimmt. Die Mittelpunkt-Redoxpotentiale betragen für die Molybdän-Redoxpaare: +223 mV (MoVI/MoV), +82 mV (MoV/MoIV); für die Fe-S-Zentren: -15 mV (FS1), < -400 mV (FS2), -8 mV (FS3), -70 mV (FS4) und für den Häm b-Kofator: +256 mV. Die reduzierte Ethylbenzol Dehydrogenase ist sauerstoffempfindlich und verliert innerhalb einer Halbwertszeit von 7 Minuten ihre Aktivität. Über Inhibitions- und Spektroskopiestudien wurde nachgewiesen, dass der mögliche Sauerstoffmetabolit Wasserstoffperoxid das Enzym inaktiviert und Kofaktoren des Enzyms beschädigt. Auch die niedermolekulare Verbindung Stickstoffmonoxid wirkt als Inhibitor und möglicherweise als Inaktivator des Enzyms. Zusätzlich wurde für Stickstoffmonoxid eine Interaktion mit den Kofaktoren der Ethylbenzol Dehydrogenase nachgewiesen. Für zukünftige Mutationsstudien mit rekombinanter Ethylbenzol Dehydrogenase wurde ein "Broad-Host-Range"-Hybridvektor hergestellt, mit welchem die Gene der Ethylbenzol Dehydrogenase nicht nur in Escherichia coli, sondern auch in anderen Organismen, wie zum Beispiel der Gattung Aromatoleum überproduziert werden können. Aufgrund der schwierigen Reinigung der Benzoylacetat-CoA Ligase aus Aromatoleum aromaticum Stamm EbN1, wurde das Gen der Benzoylacetat-CoA Ligase bal in Escherichia coli mit einem C-terminalen His-Tag exprimiert. Die lösliche und funktionelle aktive rekombinante Benzoylacetat-CoA Ligase kann nun durch Affinitätschromatographie einfach aufgereinigt werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Ethylbenzene dehydrogenase is the initial key enzyme of the anaerobic ethylbenzene degradation pathway in denitrifying beta-proteobacterium Aromatoleum aromaticum strain EbN1. The enzyme is a molybdenum enzyme and belongs to DMSO reductase family. It catalyses an oxygen-independent and stereospecific hydroxylation of ethylbenzene to (S)-1-phenylethanol. Until now the anaerobic oxidation of an aromatic hydrocarbon is an unique reaction. In the subsequent ethylbenzene degradation pathway, (S)-1-phenylethanol is oxidised to acetophenone, followed by carboxylation to benzoylacetate. Activation of this compound to the corresponding CoA-thioester by a CoA-ligase and thiolytical cleavage of benzoylacetyl-CoA leads to a central intermediate of anaerobic aromatic-pathway, benzoyl-CoA, and acetyl-CoA. In this work, ethylbenzene dehydrogenase was crystallised and the structure of enzyme was determined. Furthermore, redox active cofactors of the enzyme were specified and redox potentials were identified. A first reaction mechanism was postulated from detailed substrate and inhibition studies. In addition, a vector for cloning genes of ethylbenzene dehydrogenase was constructed to perform future mutation studies. Finally, the enzyme benzoyl-CoA ligase was overproduced recombinantly with a His-tag in Escherichia coli. In detail, the following results were obtained: Ethylbenzene dehydrogenase is a periplasmic enzyme and consists of three subunits, alpha, beta and gamma. The enzyme was crystallised anaerobically and its structure was solved at a resolution of 1,88. The architecture of cofactors is similar to those of respiratory nitrate reductase NarGHI of Escherichia coli. The alpha subunit harbors the catalytic center with one molybdenum, which is coordinated by two molybdopterin guanine dinucleotids, one of which has an unusual open pyrane ring. Electrons are transported via five iron-sulfur clusters (FS0-FS4), one of which (FS0) is located in the alpha subunit while the others (FS1-FS4) are located in the beta subunit. Iron-sulfur cluster (FS0), which is located nearby the active site exhibits an unusual histidine ligand. Terminal electron acceptor is a heme b cofactor, which is located in the gamma subunit. It is the first heme cofactor with methionine and lysine as axial ligands. From the analysis of substrate and inhibitor spectrum and detailed inhibition kinetics studies of new and already known inhibitors of ethylbenzene dehydrogenase new findings concerning the reaction mechanism of enzyme were obtained. Ethylbenzene dehydrogenase is an enzyme, which possesses a broad spectrum of approximately 20 substrates and 22 inhibitors, respectively. Among the inhibitors, both mixed and competitive inhibitors with strong affinity to the active site of the enzyme have been found. Cofactors of ethylbenzene dehydrogenase were analysed in detail via UV-Vis- and electron spin resonance spectroscopy. Thereby, one [3Fe-4S]-cluster, three of four [4Fe-4S]-clusters, one molybdenum cofactor and one heme b cofactor were identified and characterised. In addition, redox potentials of single cofactors of ethylbenzene dehydrogenase were defined. Midpoint redox potentials were determined as +223 mV (MoVI/MoV), +82 mV (MoV/MoIV) for the molybdenum redox pairs; -15 mV (FS1), <-400 mV (FS2), -8 mV (FS3), -70 mV (FS4) for iron-sulfur clusters and +256 mV for heme b. Reduced ethylbenzene dehydrogenase is oxygen-sensitive and looses its activity within a halftime of 7 minutes. Inhibition and spectroscopic studies have proved that the potential oxygen metabolite hydrogen peroxide inactivates the enzyme and damages cofactors of the enzyme. In addition, interaction of nitric oxide with cofactors of ethylbenzene dehydrogenase was demonstrated. For future studies with recombinant ethylbenzene dehydrogenase, a "broad-host-range" hybrid vector has been constructed. Therewith, the genes of ethylbenzene dehydrogenase may be overproduced not only in Escherichia coli but in other organisms like the genus Aromatoleum. To simplify the complex purification scheme of benzoylacetyl-CoA ligase from Aromatoleum aromaticum strain EbN1, the gene of benzoylacetyl-CoA ligase bal was expressed with a C-terminal his-tag in Escherichia coli. The soluble and functionally active benzoylacetyl-CoA ligase can now be purified via affinity chromatography.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:52
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000773
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-7736
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Heider, Prof. Dr. Johann and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Advisors: Heider, Prof. Dr. Johann
Refereed: 17 November 2006
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/773
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