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Funktionelle Rolle von Oberflächenladungen in der Turret-Domäne des viralen Miniatur-Kaliumkanals Kcv

von Rosenberg Lipinsky, H. Henrik :
Funktionelle Rolle von Oberflächenladungen in der Turret-Domäne des viralen Miniatur-Kaliumkanals Kcv.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2006)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Funktionelle Rolle von Oberflächenladungen in der Turret-Domäne des viralen Miniatur-Kaliumkanals Kcv
Language: German
Abstract:

Der Kaliumkanal Kcv aus dem Paramecium bursaria Chlorella Virus-1 (PBCV-1) ist einer der kleinsten funktionellen Kaliumkanäle und deshalb als Minimalmodell für die Aufklärung von Struktur-Funktions-Beziehungen besonders geeignet. Die vorliegende Arbeit ist auf funktionelle Eigenschaften von extrazellulären Oberflächenladungen fokussiert. Einem hoch konservierten Motiv von geladenen Aminosäuren in der Turret-Domäne (Asp,Lys,Lys/DKK-Motiv) kommt dabei eine zentrale Rolle zu. Während alle funktionellen Mutanten des DKK-Motivs in den Basisfunktionen des Kanals, wie Pharmakologie und Ionen-Selektivität, im Vergleich zum Wildtyp keine wesentlichen Unterschiede aufweisen, zeigten alle Mutanten eine signifikant herabgesetzte Leitfähigkeit, die im Zusammenhang mit einer reduzierten Einzelkanalleitfähigkeit diskutiert wird. Ein weiteres beobachtetes Phänomen, ist eine Verschiebung der spannungsabhängigen Eigenschaften (Aktivierungsspannung) aller Mutanten, bei denen eine oder mehrere Oberflächenladungen neutralisiert wurden. Im Extremfall führt dies zur Umkehrung der Spannungsabhängigkeit. Außerdem konnte in Bezug auf die Kinetik der Lysin-Mutanten innerhalb des DKK-Motivs eine Inaktivierung statt einer Aktivierung im biphasischen Verlauf der trägen spannungsabhängigen Komponente festgestellt werden. Alle neutralisierten Mutanten, aber auch eine ladungskonservative Mutante (K46R), weisen dieses Phänomen auf. Die veränderte Kinetik wird nicht mit einer veränderten Nettoladung, sondern mit mutationsbedingten Konformationsänderungen in Verbindung gebracht. Die experimentellen Daten führen zu dem Schluss, dass die Ladungen in der Turret-Domäne nicht essentiell für die generelle Funktion des Kanals sind und keinen Einfluss auf den Permeationsweg des Ions durch den Selektivitätsfilter haben. Die exakte sterische Beschaffenheit der Aminosäuren in der Turret-Domäne ist jedoch für funktionelle Parameter von Bedeutung. Ein um die extrazelluläre Pore gelegener negativ geladener Ring, bestehend aus Aspartat (D) ist ein weiterer Untersuchungsaspekt dieser Arbeit. Anhand von isosterischer Neutralisation mit Asparagin (N), konnten Kanaleigenschaften von Kcv grundlegend beeinflusst werden. Die hohe Kaliumselektivität und die Blockierbarkeit durch Barium gehen verloren. Zudem tendiert die Strom-Spannungs-Beziehung, mit einer typischen Abnahme an Leitfähigkeit bei negativen Spannungen, zu einem annähernd Ohmschen-Kanal mit nahezu linearer Strom-Spannungs-Beziehung. Folglich ist durch diese Mutation die Geometrie des Selektivitätsfilters, einschließlich der Barium-Bindungsstelle im Filter, grundsätzlich verändert. Theoretische Analysen zur Elektrostatik und Kaliumdichteverteilung geben Anlass zu der Annahme, dass der negativ geladene Ring um die Pore, im Zusammenspiel mit dem DKK-Motiv, „Ionenbahnen“ auf der Oberfläche des Kanals ausbilden und so die Akkumulation von Kalium vor der Pore einerseits und die Nachlieferung des Substrats aus der Peripherie des Kanals andererseits gewährleistet. Die Ergebnisse der theoretischen Untersuchungen erlauben, tolerierte und nicht tolerierte Mutationen als Kaliumdichte-erhaltende bzw. nicht erhaltende Störungen aufzufassen. Es fällt auf, dass die Kcv-Sequenz und der resultierende Proteinaufbau offenbar in der Lage sind, lokale Fluktuationen der elektrostatischen Verhältnisse zu kompensieren, um einen ungestörten Kationentransport zu ermöglichen. Die vorliegende Arbeit verschafft einen Einblick in die elektrophysiologische Relevanz der Turret-Domäne bzw. von Oberflächenladungen für den Kaliumkanal Kcv und bietet eine modellbasierte Vorstellung zur Erklärung der auftretenden Phänomene.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The Potassium channel Kcv from Paramecium bursaria Chlorella Virus-1 (PBCV-1) is the smalles known functional K+ channel and serves therefore as minimal model system to examine structure-function-relations n these proteins. The present work is concerned with the role of charged amino acids, which are located on the extracellular site of the protein. A special focus is on a highly conserved motif of charged amino acids (Asp, Lys, Lys/ DKK) the turret-domain of the Kcv channel. While all functional mutants of the DKK-motif in Kcv show no difference in ion selectivity or pharmacology compared to the wt, they exhibit a significantly reduced conductance. The latter is discussed in a context of a reduced single channel conductance. In addition all mutants in which single or multiple charges in this domain were neutralized show a shift in their voltage-dependency (activation-curves). In the extreme case the voltage dependency is even inversed. Furthermore in terms of the kinetic behaviours it was possible to observe an inactivation of the time dependent component when Lysine was mutated in the DKK-motif. All mutants with neutralized charges but also the charge-conserved mutant K46R exhibited this phenomenon. Hence the modified kinetics is not causally related to the alteration of the net charge; it must be due to a mutation dependent change in conformation. The experimental data support the conclusion that die charged amino-acids in the turret-domain of the Kcv channel are not essential for the general function of the channel and they have no influence on the permeation-pathway of the potassium ion through the selectivity-filter. However, the exact sterical properties of the amino-acids in the turret-domain are important for functional parameters. Another aspect of this study is related to a negatively charged ring at the extracellular side of the pore formed by aspartic acid (Asp/D). By means of an isosteric neutralisation of this amino acid with asparagine the channel properties where fundamentally modified. In particular a loss of potassium selectivity and a loss of barium block was observed. Furthermore die current-voltage-relationship is changed from that of a typical inward rectifier to a nearly linear I/V-curve. Hence this mutation changes the geometry of the selectivity filter including the barium binding site. Theoretical considerations concerning the electrostatic properties and the potassium density distribution foster the hypothesis that the negative charged ring around the pore forms together with the DKK-motif a potassium pathway on the surface of the channel. This pathway may facilitate the accumulation of potassium in front of the channel pore and enhance potassium delivery from the periphery of the channel. The results from the theoretical considerations suggest that functionally tolerated and non-tolerated mutations are depending on whether this particular potassium density distribution is conserved or not. A striking observation is that the Kcv sequence and the resulting protein architecture is able to compensate local electrostatic fluctuations in order to allow an undisturbed cation transport. The present study provides insight into the electrophysiological relevance of the turret-domain and surface charges respectively in the Kcv channel. Furthermore it presents a model based explanation for functional phenomena.English
Uncontrolled Keywords: geladene Aminosäuren, Dichteverteilung, Turret-Domäne, Homologiemodell, Struktur-Funktions-Beziehung
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
geladene Aminosäuren, Dichteverteilung, Turret-Domäne, Homologiemodell, Struktur-Funktions-BeziehungGerman
charged amino acids, density allocation, turret, homology modell, structure-function relationshipEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:52
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000763
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-7633
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Bertel, PD Adam
Advisors: Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 3 November 2006
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/763
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