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Immunogenic Determinants of Coagulation Factor VIII

Winterling, Karina (2018):
Immunogenic Determinants of Coagulation Factor VIII.
Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Immunogenic Determinants of Coagulation Factor VIII
Language: English
Abstract:

Hemophilia A is a bleeding disorder, affecting about 400 000 people worldwide. In addition to prolonged bleeding times, patients suffer from spontaneous and internal bleedings, affecting their everyday life. Patients can be treated by the application of therapeutic FVIII, either derived from plasma or recombinantly produced. Whether the treatment is prophylactic or on-demand depends on the severity of the disease and on the living conditions of the patients. Although treatment allows most of the patients to live a life as normal as possible, patients can develop inhibitory antibodies against the therapeutic FVIII, rendering the molecule inactive. In most cases, this situation can be overcome by an immune-tolerance-induction therapy. However, this therapy is long, strenuous and associated with very high costs. Different recombinant FVIII products evolved within the last years, containing modifications, in order to prolong the in vivo half-life of FVIII. However, a FVIII product with a reduced immunogenicity was not yet published. A deimmunized FVIII could reduce the probability of inhibitor development, providing a safer therapy for the patients and lower the costs for therapy. In this thesis, a deimmunized FVIII molecule is generated. The work comprises the full development, starting with in silico calculations of the FVIII sequence, through the production and purification, leading to final analyses in vitro and in vivo. The deimmunization approach is based on the reduction of FVIII-peptide presentation on antigen-presenting immune cells. This is supposed to lead to a prevention of naïve T cell activation. Without FVIII-specific T helper cells, naïve B cells cannot be activated, leading to the absence of high-affinity inhibitors. The in silico analysis of FVIII was based on the identification of peptides which bind with a high affinity to the major histocompatibility complex class II, which is required for cell surface-presentation of peptides. Amino acid exchanges were proposed, in order to reduce this binding. These mutations were incorporated into the FVIII sequence. This was performed in three rounds, starting with the incorporation of single mutations, followed by the combination of several mutations, to the final combination of all mutations in one molecule. Only mutations still leading to functional FVIII were finally incorporated. Based on this, 19 mutations could be incorporated into the molecule. This led to a reduction of the immunogenicity score of FVIII from 7 to -11, indicating a reduced immunogenicity based on in silico calculations. However, a total deimmunization of all epitopes was not possible, as some regions of FVIII, especially those important for activity, folding and binding, could not be altered. Functional and structural analyses of this mutated FVIII variant revealed similarity to a control FVIII as well as to commercially available recombinant FVIII products. Additionally, an in vitro DC-T cell Assay was developed, in order to determine a reduced immunogenicity of the deimmunized FVIII variant, as the available mouse models were limited. The DCs were primed with different FVIII products and the proliferative response of regulatory T cell-depleted CD4+ T cells to these DCs was measured. The regulatory T cells were depleted, in order to be able to perform this assay with cells derived from healthy donors as well as Hemophilia A patients. Using this DC-T cell Assay, cells from healthy donors proved the significantly reduced immunogenicity of the mutated FVIII variant by revealing less proliferation of T helper cells to this variant than to the control FVIII. These results have further to be proven with cells derived from Hemophilia A patients. Unfortunately, the detection of a reduced immunogenicity in vivo was limited. Two mouse models were tested but the models had either a FVIII knockout or a human immune system. However, a combination of these two models would have been optimal but was not available. Finally, this thesis presents the first deimmunized FVIII, containing 19 amino acid mutations, which is still active and proves to be less immunogenic in an in vitro assay with cells from healthy donors. Upon confirmation of these results in vivo, this molecule can highly improve the therapy of Hemophilia A patients by reducing the risk of inhibitor development in previously treated as well as in previously untreated patients. This reduced inhibitor incidence would also reduce the costs of therapy, as inhibitor-negative patients would not require an expensive immune-tolerance-induction therapy.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Hämophilie A ist eine Störung der Blutgerinnung, die weltweit 400 000 Menschen betrifft. Neben verlängerten Blutungszeiten leiden Patienten unter spontanen und inneren Blutungen, die ihr tägliches Leben beeinflussen. Die Behandlung erfolgt mithilfe von therapeutischem FVIII, welcher entweder aus Plasma gewonnen oder rekombinant hergestellt wird. Ob eine Behandlung prophylaktisch oder nur bei Bedarf erfolgt, hängt von der Schwere der Krankheit und den Lebensumständen des Patienten ab. Obwohl die Behandlung den meisten Patienten ein nahezu normales Leben ermöglicht, können Patienten Inhibitoren gegen den therapeutischen FVIII entwickeln, die diesen inaktivieren. In den meisten Fällen kann dies durch eine Immuntoleranztherapie behandelt werden. Diese Therapie ist jedoch lang, strapaziös und sehr teuer. In den vergangenen Jahren wurden verschiedene rekombinante FVIII Produkte mit Modifikationen zur Verlängerung der in vivo Halbwertszeit entwickelt. Ein FVIII Produkt mit einer verringerten Immunogenität wurde jedoch noch nicht publiziert. Ein deimmunisierter FVIII könnte die Wahrscheinlichkeit einer Inhibitorentstehung verringern und so eine bessere Therapie für die Patienten ermöglichen. In dieser Thesis wird eine deimmunisierte FVIII Variante entwickelt. Die Arbeit umfasst die vollständige Entwicklung, begonnen mit den in silico Berechnungen, über die Produktion und Reinigung, bis zu den in vitro und in vivo Analysen. Der Deimmunisierungsansatz beruht auf einer Verringerung der FVIII-Peptidpräsentation auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Immunzellen. Dadurch soll verhindert werden, dass naive T-Zellen aktiviert werden. Ohne FVIII-spezifische T-Helferzellen können wiederum keine naiven B-Zellen aktiviert werden, was zu einem Ausbleiben von hochaffinen Inhibitoren führt. Dadurch wird die Produktion der Antikörper bereits auf der Ebene der T-Zellen unterbunden. Während der in silico Analyse wurden Peptide identifiziert, die mit hoher Affinität an den Haupthistokompatibilitätskomplex II binden, welcher für die Präsentation von Peptiden auf der Zelloberfläche benötigt wird. Anschließend wurden Aminosäureaustausche vorgeschlagen, um diese Bindung zu verringern. Der Einbau der Mutationen in die FVIII Sequenz wurde in drei Runden durchgeführt, begonnen mit dem Einbau von Einzelmutationen, gefolgt von der Kombination mehrerer Mutationen bis zur finalen Kombination aller Mutationen. Nur Mutationen, die zu einem funktionalen FVIII führten, wurden in die nächste Runde transferiert. Final konnten 19 Mutationen in die Sequenz eingebaut werden. Dies führte, basierend auf in silico Berechnungen, zu einer Reduzierung des Immunogenitätswerts von 7 auf -11. Eine vollständige Deimmunisierung war jedoch nicht möglich, da besonders aktivitäts-, faltungs- und interaktionsrelevante Regionen des FVIII nicht verändert werden konnten. Funktionale und strukturelle Analysen des mutierten FVIII zeigten Ähnlichkeiten zu einem Kontroll-FVIII und zu kommerziell erwerblichen FVIII Produkten. Zusätzlich wurde ein in vitro DC-T-Zell Test entwickelt, um die reduzierte Immunogenität der deimmunisierten FVIII Variante nachzuweisen, da dies mit den zur Verfügung stehenden in vivo Modellen nur begrenzt möglich war. Für diesen Test wurden DCs mit verschiedenen FVIII Produkten vorinkubiert und anschließend zusammen mit CD4+ T-Zellen kultiviert. Final wurde die Proliferation von CD4+ T-Zellen analysiert. Aus der untersuchten CD4+ T-Zell Population wurden vor der Kultivierung die regulatorischen T-Zellen depletiert. Dies wurde durchgeführt, um den Test sowohl mit Zellen von gesunden Spendern als auch von Hämophilie A Patienten durchführen zu können. Mit Zellen von gesunden Spendern bestätigte der Test eine signifikant verringerte Immunogenität des mutierten FVIII im Vergleich zum Kontroll-FVIII. Diese Ergebnisse müssen noch mit Zellen von Hämophilie A Patienten belegt werden. Leider konnte diese verringerte Immunogenität in vivo nur begrenzt nachgewiesen werden. Zwei Mausmodelle wurden getestet, jedoch hatten diese entweder ein humanes Immunsystem oder einen FVIII-Knockout. Eine Kombination aus beiden Modellen wäre optimal gewesen, war jedoch nicht verfügbar. Insgesamt zeigt diese Thesis den ersten deimmunisierten und aktiven FVIII mit 19 Mutationen, der in einem in vitro Test mit Zellen von gesunden Spendern eine verringerte Immunogenität aufweist. Wenn diese Ergebnisse in vivo bestätigt werden können, kann dieses Molekül die Therapie von Hämophilie A Patienten deutlich verbessern, indem es das Risiko einer Inhibitorentstehung verringert. Diese Verringerung der Inhibitorinzidenz würde zudem auch die Therapiekosten verringern, da Inhibitor-negative Patienten keine teure Immuntoleranztherapie benötigen.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 29 Jun 2018 07:10
Last Modified: 09 Jul 2020 02:08
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-75067
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Schüttrumpf, Dr. Jörg
Refereed: 11 June 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7506
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