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Molecular explanations for gating in simple model K+ channels

Rauh, Oliver (2018):
Molecular explanations for gating in simple model K+ channels.
Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Molecular explanations for gating in simple model K+ channels
Language: English
Abstract:

Potassium channels are transmembrane proteins that facilitate the passive and selective flux of K+ ions across biological membranes in cells of virtually all species. They are involved in a broad variety of cellular and physiological processes such as neuronal excitability, muscle contraction, volume regulation and secretion. Consequently, the understanding of these processes and their pathological dysfunctions requires insights into the molecular mechanisms underlying the functions of potassium channels. The focus of the present thesis is placed on the investigation of gating mechanisms in potassium channels. For this purpose, I used small viral encoded KcvATCV-1-like potassium channels, which resemble with a monomer size of only 82 amino acids, the pore module of all complex potassium channels in terms of structure and function. In the first part of this work two members of the KcvATCV-1-family, KcvS and KcvNTS, are used in a comparative experimental and computational analysis to examine the mechanistical and chemical explanation of a particular gating process. Even though both proteins share about 90% amino acid sequence identity they exhibit different open probabilities with ~90% in KcvNTS and ~40% in KcvS. Single-channel analysis, mutational studies and molecular dynamics simulations show that the difference in open probability is the result of a single long-lasting closed state in KcvS. This closed state is caused by the formation of a transient, intrahelical hydrogen-bond between the side chain of a serine located in the pore-lining transmembrane helix and a carbonyl oxygen in the preceding helix turn. This hydrogen-bond induces a kink, which promotes an interaction of aromatic groups from downstream phenylalanine residues at the intracellular pore entrance that blocks ion flux. The second part deals with the investigation of the kinetics and molecular causes of a voltage-dependent gating process in KcvNH S77G. This channel exhibits in multi-channel bilayer experiments in response to membrane hyperpolarization a time-dependent, ultra-slow inactivation, resulting in an outwardly-rectifying current-voltage relationship. Single-channel measurements demonstrate that this inactivation is caused by the voltage-dependent transition from an active state, in which the channel exhibits an open probability of about 90%, to an ultra-long-lasting, voltage-insensitive inactive state. The transition into the inactive state is sensitive to both the external potassium concentration and the electrochemical driving force. The electrophysiological experiments, the kinetic information extracted from these and the agreement of model-based predictions with experimentally obtained data support the hypothesis that inactivation is directly coupled to the permeation of ions through the channel pore. These results provide a plausible mechanistic explanation on how ion channels without a VSD in general can sense a change in membrane voltage.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Kaliumkanäle sind Transmembranproteine, die Kaliumionen den passiven und selektiven Durchtritt durch biologische Membranen ermöglichen und in den Zellen nahezu aller Organismen zu finden sind. In diesen sind sie an einer Vielzahl zellulärer und physiologischer Prozesse beteiligt, zu denen die Generierung und Weiterleitung von Aktionspotentialen in neuronalen Zellen, die Kontraktion von Muskelzellen, die Regulation des Zellvolumens sowie Sekretionsvorgänge gehören. Das Verständnis dieser Prozesse sowie ihrer pathologischen Störungen muss daher zwangsläufig auch das Verständnis der molekularen Mechanismen umfassen, die der Funktion von Kaliumkanälen zugrunde liegen. Zu diesem Zweck verwende ich in der vorliegenden Arbeit viral kodierte KcvATCV-1-ähnliche Kaliumkanäle, die mit einer Größe von lediglich 82 Aminosäuren je Monomer strukturell und funktionell dem Porenmodul komplexerer Kaliumkanäle entsprechen. Im ersten Teil der vorliegenden Thesis werden zwei Mitglieder der KcvATCV-1-Familie, KcvS und KcvNTS, verwendet, um unter Verwendung experimenteller und simulationsbasierter Methoden die mechanistischen und chemischen Ursachen eines bestimmten Gating-Prozesses zu untersuchen. Trotz einer Sequenzübereinstimmung von annähernd 90%, weist KcvS mit etwa 40% eine deutlich niedrigere Offenwahrscheinlichkeit auf als KcvNTS, der mit einer Offen-wahrscheinlichkeit von etwa 90% als konstitutiv offen betrachtet werden kann. Durch Kombination von Einzelkanalmessungen, Mutationsstudien und Moleküldynamiksimulationen kann gezeigt werden, dass die niedrigere Offenwahrscheinlichkeit des KcvS durch das Auftreten eines zusätzlichen, langlebigen Geschlossenzustandes hervorgerufen wird. Dieser Geschlossenzustand kann wiederum auf eine transiente, intrahelikale Wasserstoffbrücke zurückgeführt werden, die sich innerhalb der inneren Transmembranhelix zwischen der Seitengruppe eines Serins und einem Carbonylsauerstoff des Peptidrückgrates ausbildet. Diese Wasserstoffbrücke bedingt eine Änderung der Helixgeometrie und dadurch eine Änderung in der Orientierung eines unterhalb des Serins gelegenen Phenylalanins. Die Interaktion der vier Phenylalaninseitengruppen innerhalb der Pore des tetrameren Kaliumkanals führt schließlich zur Blockierung des Ionenstroms. Der zweite Teil befasst sich mit der Untersuchung der molekularen Ursachen eines spannungsabhängigen Gating-Prozesses im viralen Kaliumkanal KcvNH S77G. Dieser Kanal zeigt in Multikanal-Experimenten nach Hyperpolarisation der Lipidmembran eine zeitabhängige, ultra-langsame Inaktivierung. Diese verleiht dem KcvNH S77G eine für Auswärtsgleichrichter charakteristische Strom-Spannungsbeziehung. Durch Einzelkanalmessungen kann gezeigt werden, dass die Inaktivierung das Resultat eines spannungsabhängigen Übergangs von einem aktiven Zustand, in dem der Kanal eine Offenwahrscheinlichkeit von etwa 90% aufweist, in einen ultra-langlebigen, spannungsunabhängigen inaktiven Zustand widerspiegelt. Der Übergang in den inaktiven Zustand ist sowohl von der externen Kaliumkonzentration als auch von der elektrochemischen Triebkraft abhängig. Die durchgeführten Experimente, die aus diesen extrahierten kinetischen Informationen sowie die Übereinstimmung modellbasierter Voraussagen mit experimentell gewonnenen Daten unterstützen die Hypothese, dass die Inaktivierung eine direkte Folge der Ionenpermeation darstellt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen liefern eine schlüssige mechanistische Erklärung, wie Ionenkanäle, die über keine Spannungssensordomäne verfügen, Änderungen in der Membranspannung sensieren und in das Öffnen oder Schließen der Kanalpore übersetzen können.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Plant Membrane Biophysics
Date Deposited: 30 May 2018 06:18
Last Modified: 30 May 2018 06:18
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-74372
Referees: Schröder, Dr. Indra and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 22 May 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7437
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