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Endocytose und Exocytose in Saccharomyces cerevisiae

Cucu, Bayram (2018):
Endocytose und Exocytose in Saccharomyces cerevisiae.
Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

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Text (Ph.D. Thesis)
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Endocytose und Exocytose in Saccharomyces cerevisiae
Language: German
Abstract:

In der vorliegenden Arbeit wurden endocytotische und exocytotische Aktivität in Hefeprotoplasten mit Hilfe der Patch-Clamp Methode untersucht. Eine Variante dieser Methode erlaubt es, Änderungen der Membranfläche wie sie aus individuellen Ereignissen der Vesikelfusion oder Vesikelabschnürung resultieren, als Änderung der Membrankapazität mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu untersuchen. Die Kapazitätsmessungen werden dabei an kleinen Membranarealen durchgeführt. Dies erlaubt Einzelereignisse zu registrieren, wobei die Auflösungsgrenze in den hier vorgestellten Messungen im Bereich von etwa 0,1 fF lag. Dies entspricht einer Vesikelgröße von etwa 60 nm und würde damit ausreichen, um die Abschnürung von Clathrin-umhüllten Vesikel, die eine Größe von 50 -100 nm aufweisen, gerade noch zu erfassen. In Protoplasten von Wildtyp Hefezellen konnten exocytotische Ereignisse als Kapazitätserhöhungen mit einer mittleren Größe (Median) von 0,4 fF und endocytotische Ereignisse als Kapazitätserniedrigungen von 0,36 fF gemessen werden. Dies entspricht Durchmessern von 126 nm für sekretorische Vesikel und 120 nm für endocytotische Vesikel. Hefeprotoplasten wachsen in osmotisch stabilisierendem Puffer mit Glucose als Kohlenstoffquelle kontinuierlich über mehrere Tage, ohne Knospen zu bilden und sich vegetativ zu vermehren. Dies ist konsistent mit der Beobachtung, dass in Protoplasten von Wildtypzellen ein leichtes Ungleichgewicht zugunsten exocytotischer Aktivität (fex) gegenüber endocytotischer Aktivität (fend) von fex/fend = 1,6 herrscht. Dieses leichte Ungleichgewicht war in Clathrin-Deletionsmutanten gestört. Während die Deletion des Gens für die schwere Clathrinkette, CHC1, zu einer leichten Inhibierung der Endocytose führte, kam die endocytotische Aktivität in CLC1-Deletionsmutanten fast vollständig zum Erliegen. Das Verhältnis fex/fend stieg in der CHC1-Deletionsmutante auf 2,6 und in der CLC1-Deletonsmutante auf 21,0. Dies resultierte in einer Steigerung des Protoplastenwachstums gegenüber Protoplasten aus Wildtypzellen, wobei der positive Effekt auf das Wachstum der Protoplasten aus der CLC1-Deletionsmutante deutlich stärker war, als das der Protoplasten aus der CHC1-Deletionsmutante. Offensichtlich ist die endocytotische Aktivität in der Bäckerhefe sehr viel stärker von Clc1p abhängig, als von Chc1p. Der Grund dafür könnte in der Funktion von Clc1p als regulatorisches Element für die Trimerisierung von Chc1p und somit für die Bildung des Clathrinmantels und in seiner Funktion als Bindeglied für die Anheftung von Actin an die Membran liegen. Actin fungiert als treibende Kraft für die Membraninvagination und Ablösung von endocytotischen Vesikeln. Neben den Strukturproteinen Clc1p und Chc1p, die das Clathringerüst bilden, konnte die Lipidzusammensetzung der Membran als wichtiger Faktor für die exocytotische und endocytotische Aktivität in der Bäckerhefe identifiziert werden. Um die Rolle von Lipiden bei Endo- und Exocytose zu untersuchen, wurden Hefestämme verwendet, in denen die Expression von Schlüsselenzymen des Lipidstoffwechsels reguliert werden konnte. Durch Austausch des POLE1-Promotors gegen den Methionin-reprimierbaren PMET3-Promotor war es möglich durch Reprimierung der OLE1-Expression den Gehalt an einfach-ungesättigten Fettsäuren in Hefe von 80% auf 25% zu reduzieren. Die Reduzierung des Anteils einfach-ungesättigter Fettsäuren resultiert in einer Verringerung der Membranfluidität und in einer Reduzierung der exocytotischen und endocytotischen Aktivität, wobei der inhibitorische Effekt auf die endocytotische Aktivität stärker war, als auf die exocytotische Aktivität. Durch diese Reduzierung der Membranfluidität wurde 85% der endocytotischen Aktivität gehemmt. Nicht nur der Anteil ungesättigter Fettsäuren in der Membran spielt eine Rolle für endocytotische und exocytotische Aktivität, sondern auch die Dotierung der Membran mit Sterolen, wobei dies in Hefe vorwiegend Ergosterol ist. Hemmung der Ergosterolbiosynthese in einem Hefestamm mit regulierbarer Expression von ERG9 führte zu einer Halbierung der endocytotischen Aktivität, während dies keinen Einfluss auf die exocytotische Aktivität hatte. Hier stellte sich die Frage, ob die Hemmung der endocytotischen Aktivität auf eine Änderung der Membranfluidität oder auf die Auflösung von Lipid Rafts, die als Orte der Endocytose diskutiert werden, zurückzuführen ist. Die in elektrophysiologischen Experimenten gemessenen Änderungen der endocytotischen und exocytotischen Aktivitäten in Abhängigkeit der Lipidkomposition (ungesättigte Fettsäuren und Ergosterol-Gehalt) konnten durch fluoreszenz-optische Experimente bestätigt werden. Dabei wurde die Expression und Plasmamembran-Lokalisation eines GFP-Fusionsproteins (Tok1p-GFP) als Indiz für korrekte Exocytose und die Internalisierung des lipophilen Farbstoffs FM4-64 als Endocytosemarker verwendet.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The aim of the study was to investigate endocytotic and exocytotic activity in yeast protoplast with the patch-clamp method. A special application of the patch-clamp technique, allows determining changes in membrane surface emerged from individual events of vesicle fusion and fission, which results in changes of membrane capacity with high temporal and spatial resolution. The high-resolution membrane capacitance measurements have been performed on small membrane patches, allowing to record single events, whereby the limit of resolution was in the range of approximately 0.1 fF and corresponds to a vesicle size of approximately 60 nm, enabling to record the fission of clathrin-coated vesicles (CCV), which have a vesicle size of 50-100 nm. Exocytotic events specified as increase in capacity with an average size (median) of 0.4 fF and endocytotic events, specified as decrease in capacity with a median of 0.36 fF could be recorded in yeast wildtype protoplast, which corresponds to vesicle size in diamaters of 126 nm for secretory and 120 nm for endocytotic vesicles. Yeast protoplasts grow in osmotic stabilizing buffer, with glucose as a carbon source, continuously for several days without bud formation or vegetative propagation. This is consistent with the observation that protoplast of wildtype cells show a slight imbalance in favor to exocytotic activity (fex) over endocytotic activity (fend) of fex/fend= 1.6 . This slight imbalance was disturbed in clathrin mutants. While deletion of the CHC1 gene (coding for the clathrin-heavy chain) resulted in a weak inhibition of endocytosis, endocytotic activity in CLC1 (coding for the clathrin-light chain) deletion strains was almost completely ceased. The ratio fex/fend increased to 2.6 in CHC1 deletion strains and to 21.0 in CLC1 deletion mutants. This resulted in an increase in protoplast growth over wildtype protoplasts, with the positive effect on the growth of CLC1 deletion protoplasts being significantly larger than CHC1 deletion protoplasts. Obviously, endocytotic activity in baker´s yeast is more dependent on Clc1p then Chc1p. An Explanation could rely in the function of Clc1p. Clc1p is a regulatory element in the trimerization of Chc1p and thus in the formation of clathrin coats, whereby Clc1p is a link for actin assembly on the membrane. Actin acts as the driving force for membrane invagination and fission of endocytotic vesicles. In addition to structural proteins Clc1p and Chc1p, which form the clathrin scaffold, the lipid composition of the membrane could be identified as an important factor for exocytotic and endocytotic activity in baker´s yeast. To investigate the role of lipids in the process of endocytosis and exocytosis, yeast strains have been used, in which the expression of important key-enzymes could be regulated in order to manipulate the lipid metabolism. By replacing the POLE1 promotor with the methionine-repressible PMET3 promotor, it was possible to reduce the level of monounsaturated fatty acids (MUFA) in yeast from 80 % to 25 % by repressing OLE1 expression. The decrease of MUFA proportion resulted in a reduction of membrane fluidity and also in a reduction of endocytotic and exocytotic activity, whereby the inhibitory effect on endocytosis was bigger over exocytosis. The reduction of membrane fluidity resulted in an inhibition of 85 % endocytotic activity. Not only the proportion of unsaturated fatty acids in the membrane has a high impact on endocytotic and exocytotic activity, but also the doping of the membrane with sterols, which is predominantly ergosterol in yeast. Inhibition of ergosterol biosynthesis in yeast strains with modifiable expression of ERG9 halved endocytotic activity, while exocytotic activity was not affected. The question was whether the inhibition of endocytotic activity is due to changes in membrane fluidity or due to dissolution of lipid rafts, which are suspected as sites for endocytosis. The changes in endocytotic and exocytotic activities as a function of lipid composition (unsaturated fatty acids and ergosterol content) measured in electrophysiological experiments could be confirmed by fluorescence-optical methods. The expression and plasma membrane localization of a GFP fusion protein (Tok1-GFP) was used as an indication of correct exocytosis. The internalization of the lipophilic dye FM4-64 was used as an endocytosis marker.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Yeast Membrane Biology
Date Deposited: 20 Apr 2018 05:56
Last Modified: 09 Jul 2020 02:03
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-73172
Referees: Bertl, Prof. Dr. Adam and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 28 March 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7317
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