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Molekulare Analyse der Interaktion der Disintegrin-Metalloproteinase ADAM15 mit der Fokalen Adhasionskinase und dem Poly(A)-Binding Protein in osteoarthrotischen Chondrozyten

Fried, Dorothee :
Molekulare Analyse der Interaktion der Disintegrin-Metalloproteinase ADAM15 mit der Fokalen Adhasionskinase und dem Poly(A)-Binding Protein in osteoarthrotischen Chondrozyten.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2018)

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20180317.pdf - Accepted Version
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Molekulare Analyse der Interaktion der Disintegrin-Metalloproteinase ADAM15 mit der Fokalen Adhasionskinase und dem Poly(A)-Binding Protein in osteoarthrotischen Chondrozyten
Language: German
Abstract:

ADAM15 (A Disintegrin And Metalloproteinase 15) ist ein aus mehreren Domänen bestehendes Transmembranprotein. Neben den extrazellulären Pro-, Metalloproteinase-, Disintegrin-, Cystein-reichen- und EGF-ähnlichen Domänen beinhaltet es auch eine zytoplasmatische Domäne. Die erhöhte Expression von ADAM15 ist assoziiert mit aggressiven Krebsformen, wie beispielsweise Burst- und Prostatakrebs. Darüber hinaus wird eine hohe Expression von ADAM15 in nicht-neoplastischen und entzündlichen Geweben, mit denen ein Umbau der extrazellulären Matrix einhergeht, wie zum Beispiel Osteoarthrose nachgewiesen. Die Funktion von ADAM15 im osteoarthrotischen Knorpel ist allerdings nicht destruktiv sondern homöostatisch, wie ein ADAM15-defizientes Mausmodell und mit ADAM15 transfizierte chondrozytäre Zellen, die eine höheren Apoptose-Resistenz aufwiesen, darlegten. ADAM15 ist fähig durch genotoxischen Stress induzierter Apoptose durch die Suppression der Aktivierung von Caspase-3 entgegenzuwirken. Eine Zelllinie, die das Plasmamembran-gebundene ADAM15 ohne zytoplasmatische Domäne exprimierte, hatte diese anti-apoptotische Fähigkeit verloren, was eine bedeutende Rolle der intrazellulären Domäne als ein Gerüst für die Rekrutierung von Signal-übermittelnden Kinasen vermuten ließ. Zusätzlich war die Frage der direkten molekularen Interaktion der zytoplasmatischen Domäne von ADAM15 mit der Fokalen Adhäsionskinase (FAK), basierend auf dem bereits publizierten modulierenden Einfluss von ADAM15 auf die FAK-Signalwege, offen. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die spezifische Bindung der Linker-Region zwischen der Kinase- und FAT-Domäne der FAK an die zytoplasmatische Domäne von ADAM15 eindeutig mittels Mammalian Two-Hybrid-, Pulldown- und Dot Blot-Versuchen bewiesen werden. Desweiteren wurde eine erhöhte Phosphorylierung der FAK an den Tyrosinresten Y397, Y576 und Y861 nach der Induktion von genotoxischem Stress mittels Camptothecin in ADAM15-transfizierten T/C28a4 Chondrozyten detektiert. Die Hypothese, dass die zytoplasmatische Domäne von ADAM15 ein sensiertes extrazelluläres Signal übermitteln kann und daraus folgend zu einer Erhöhung der FAK-Phosphorylierung führt, wurde mittels der IL-2-Stimulation von Zellen, die mit einem chimären Konstrukt bestehend aus der extrazellulären IL-2 Rezeptor-Untereinheit α und der zytoplasmatischen Domäne von ADAM15 transfiziert waren, bestätigt. Als Folge der ADAM15-abhängigen FAK-Phosphorylierung kommt es zur Bildung eines aktivierten FAK-Src-Komplexes, der zur Aktivierung von Überlebens-Signalwegen führt. Die neu entdeckte gegen-regulatorische Antwort auf genotoxischen Stress ist nicht nur im chondrozytären Überlebens-Signalweg sondern auch potentiell für die Apoptose-Resistenz im neoplastischen Wachstum relevant. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Bindung der Poly(A)-Binding Proteins (PABP) an ADAM15 analysiert. Auf Grund der potentiellen Funktionen der zytoplasmatischen Domäne von ADAM15 bei pathophysiologischen Vorgängen, wie sie bei verschiedenen Splice-Varianten von ADAM15, die zu unterschiedlich metastatischem Zellverhalten führen, beobachtet werden, wurden weitere Interaktionspartner mittels MALDI-TOF gesucht. Dadurch wurde PABP als Bindungspartner identifiziert und in Ko-Immunpräzipitationsversuchen bestätigt. Mittels ELISA- und Mammalian Two-Hybrid-Versuchen wurde die spezifische Bindung der Prolin-reichen Linker Region zwischen RRM4 (RNA Recognition Motive 4) und C-terminaler PABC-Domäne von PABP an die zytoplasmatische Domäne von ADAM15 bewiesen. Die Ko-Lokalisation von ADAM15 und PABP an der Plasmamembran in OA-Chondrozyten und K4IM-Synovialfibroblasten konnte allerdings nur während der Re-Adhäsion der Zellen beobachtet werden. Mittels des etablierten Re-Adhäsions-Assays ließ sich die von der zytoplasmatischen Domäne von ADAM15 abhängige, temporäre Lokalisation von PABP an der Plasmamembran in ADAM15-transfizierten T/C28a4-Chondrozyten nachweisen. Da PABP als RNA-bindendes Protein an der Translationsregulation beteiligt ist, wurde die Translation an der Plasmamembran unter Verwendung von Puromycin und anti-Puromycin Antikörpern untersucht. Sowohl mit ADAM15 als auch mit PABP wurde die Translation in re-adhärierten OA-Chondrozyten und K4IM-Synovial¬fibroblasten ko-lokal an der Plasmamembran detektiert. Weiterhin konnte die Abhängigkeit von ADAM15 dieser Translations-Lokalisation in ADAM15-transfizierten T/C28a4-Chondrozyten und ADAM15-herab-regulierten HeLa-Zellen bewiesen werden. Die subzelluläre Lokalisation von PABP und folglich der Translation könnte durch einen Verankerungsmechanismus an der Plasmamembran mittels ADAM15 hervorgerufen werden, resultierend in einer Bildung von Membranfortsätzen (Lamellipodien), die zur Adhäsion oder Migration der Zelle führen. Die Fähigkeit einer Zelle Lamellipodien zu bilden ist ein wichtiger Schritt der Metastasierungskaskade, auf welche die Expression von ADAM15 einen Einfluss haben könnte.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
ADAM15 (A Disintegrin And Metalloproteinase 15) is a transmembrane protein consisting of multiple domains. Besides the extracellular pro-, metalloproteinase-, disintegrin-, cysteine-rich and EGF-like domains it also contains a cytoplasmic domain. The enhanced expression of ADAM15 is associated with aggressive forms of cancer like breast and prostate cancer. Furthermore a high expression of ADAM15 in non-neoplastic and inflammatory tissues is detected which is associated with the remodeling of extracellular matrix for example in osteoarthritis. But the function of ADAM15 in osteoarthritic cartilage is not destructive but rather homeostatic which has been shown in an ADAM15 deficient mouse model and ADAM15 transfected chondrocytic cells which had an increased apoptosis resistance. ADAM15 has the ability of reducing genotoxic stress induced apoptosis by suppressing the activation of caspase-3. A cell line which expressed the plasma membrane bound ADAM15 without the cytoplasmic domain had lost its anti-apoptotic function which suggests an important role of the intracellular domain as a scaffold for the recruitment of signal transducing kinases. Additionally the question of direct molecular interactions of the cytoplasmic domain of ADAM15 with the focal adhesion kinase (FAK) was raised based on the already published modulating effect of ADAM15 to FAK signaling pathways. Within the first part of this thesis a specific binding between the linker region of the FAK, which lies between its kinase and FAT domain, and the cytoplasmic domain of ADAM15 could be clearly demonstrated by using Mammalian Two-Hybrid, Pulldown and Dot Blot techniques. Furthermore an increased FAK phosphorylation at tyrosine residues Y397, Y576 and Y861 after induction of genotoxic stress by camptothecin in ADAM15 transfected T/C28a4 chondrocytes was detected. The hypothesis of the cytoplasmic domain of ADAM15 as transmitting extracellular signals and downstream leading to an increase of FAK phosphorylation was proved by IL-2 stimulation of cells that were transfected with a chimeric construct consisting of the extracellular IL-2 receptor subunit α and the cytoplasmic domain of ADAM15. As a consequence of the ADAM15 dependent FAK phosphorylation the FAK-Src complex becomes activated leading to the activation of survival signaling pathways. This newly discovered counter regulatory answer to genotoxic stress is not only relevant in the chondrocytic survival signaling pathway but also potentially relevant for the apoptosis resistance in neoplastic growth. In the second part of this thesis the binding of the Poly(A)-Binding Protein (PABP) to ADAM15 was analyzed. Due to the potential function of the cytoplasmic domain of ADAM15 in pathophysiological processes, as they are observed in different splice variants of ADAM15 that lead to different metastatic behavior of the cell, further interaction partners were screened by using MALDI-TOF. Thereby PABP was identified as binding partner which was confirmed by co-immunoprecipitation experiments. By ELISA and Mammalian Two-Hybrid experiments the specific binding of the proline rich linker region between RRM4 and the C-terminal PABC domain of PABP and the cytoplasmic domain of ADAM15 was shown. The co-localization of ADAM15 and PABP at the plasma membrane of OA chondrocytes and K4IM synovial fibroblasts was only present during re-adhesion of the cells. Through the established re-adhesion assay a cytoplasmic domain of ADAM15 dependent, temporary localization of PABP at the plasma membrane in ADAM15 transfected T/C28a4 chondrocytes could be proved. Since PABP is involved in translation regulation as RNA binding protein, translation at the plasma membrane was analyzed using puromycin and anti-puromycin antibodies. Translation at the plasma membrane was detected co-local with ADAM15 as well as PABP in re-adhering OA chondrocytes and K4IM synovial fibroblasts. Furthermore the ADAM15 dependency of this translation localization in ADAM15-transfected T/C28a4 chondrocytes and ADAM15 down regulated HeLa cells was shown. The subcellular localization of PABP and downstream of the translation could be triggered by an anchoring mechanism at the plasma membrane through ADAM15 resulting in the formation of membrane protrusions (lamellipodia) which lead to adhesion or migration of the cell. The ability of a cell to form lamellipodia is an important step of the metastasis cascade which could be influenced by the expression of ADAM15.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 07 Jun 2018 06:31
Last Modified: 07 Jun 2018 06:31
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-72798
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Burkhardt, Prof. Dr. Harald
Refereed: 20 December 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7279
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