TU Darmstadt / ULB / tuprints

Einfluss von Phosphodiesterase 4 und Proteinphosphatase 1 auf die Regulation proinflammatorischer Cytokine und Stickstoffmonoxid in Lipopolysaccharid-aktivierten Makrophagen

Ohlweiler, Sibylle :
Einfluss von Phosphodiesterase 4 und Proteinphosphatase 1 auf die Regulation proinflammatorischer Cytokine und Stickstoffmonoxid in Lipopolysaccharid-aktivierten Makrophagen.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2006)

[img]
Preview
PDF
Sibylle_ganz_v13.pdf
Available under Simple publication rights for ULB.

Download (1805Kb) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Einfluss von Phosphodiesterase 4 und Proteinphosphatase 1 auf die Regulation proinflammatorischer Cytokine und Stickstoffmonoxid in Lipopolysaccharid-aktivierten Makrophagen
Language: German
Abstract:

Eine positive Eigenschaft der proinflammatorischen Cytokine IL-1b, TNFa und IL-6 ist die Regulation der Immunabwehr. Diese Substanzen werden u.a. von Makrophagen produziert, die durch den Kontakt mit dem Lipopolysaccharid Gram-negativer Bakterien aktiviert werden. Bei einer dauerhaft verstärkten Produktion dieser inflammatorischen Mediatoren kann es zur Ausbildung von chronischen Entzündungserkrankungen kommen, weshalb es von zentraler Bedeutung ist, die Regulation der Cytokinproduktion zu verstehen, um geeignete Therapeutika zur Behandlung dieser Krankheiten entwickeln zu können. Die Induktion zur Expression des IL-1b-Gens erfolgt in LPS-stimulierten Makrophagen rapide, aber transient. In früheren Untersuchungen der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass eine negative Regulation von IL-1b erst 8 bis 12 Stunden nach LPS-Stimulierung von murinen Makrophagen einsetzt. Diese Regulation wurde hauptsächlich auf der Ebene der Transkription ausgeübt! . In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen dieser Kontrolle in LPS-stimulierten RAW 264.7-Makrophagen näher untersucht. Durch Hinweise in der Literatur wurde vermutet, dass diese Kontrolle womöglich im Protein-Kinase A (PKA)-Weg ausgeübt wird. Da cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) von großer Bedeutung innerhalb dieses Signalweges ist, wurde zunächst exogenes cAMP als Modulator des PKA-Weges eingesetzt. Die zwischen 8 und 12 Stunden nach LPS-Stimulierung erstmals zu beobachtende negative Regulation von IL-1b konnte durch die Zugabe exogenen cAMPs aufgehoben werden. Die mRNA-Akkumulation und die Produktion von IL-1b wurden hierdurch deutlich verstärkt. Die Bedeutung weiterer für die Produktion von IL-1b möglicherweise wichtiger Regulationsstellen im PKA-Weg wurde durch den Einsatz spezifischer Inhibitoren untersucht. Durch den Einsatz von Rolipram, einem spezifischen Inhibitor der PDE4, die das intrazelluläre cAMP-Lev! el kontrolliert, wurde die LPS-induzierte negative Regulation von IL-1 b ab 12 Stunden aufgehoben. Die IL-1b-mRNA-Akkumulation und -Produktion wurden ebenfalls deutlich verstärkt. Es wurde desweiteren vermutet, dass die Proteinphosphatase 1 (PP1), die den Transkriptionsfaktor CREB dephosphoryliert, eine weitere Kontrolle über die IL-1b-Produktion im PKA-Weg ausüben könnte. Wie bei der Verwendung von Rolipram wurde durch den PP1-Inhibitor Tautomycin die negative Regulation von IL-1b ab 12 Stunden nach LPS-Stimulierung aufgehoben und sowohl die IL-1b-Produktion als auch die mRNA-Akkumulation verstärkt. Die PDE4 und die PP1 scheinen an der negativen Regulation von IL-1b zudem auf der Ebene der Promotor-Aktivität beteiligt zu sein, wie durch Transfektionsversuche mit IL-1b-Promotor-Reportergen-Konstrukten gezeigt werden konnte. Im Verlauf der Arbeit wurde deutlich, dass der Bereich zwischen dem Enhancer und dem minimalen Promotor des IL-1b-Gens womöglich wesentlich für die negative IL-1b-Regulation ist. Da in! der Literatur vielfach auf die Bedeutung des PKA-aktivierbaren Transkriptionsfaktors CREB für die IL-1b-Produktion hingewiesen worden war, sollte eingehender untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen der Aufhebung der negativen Regulation von IL-1b und dem Aktivierungszustand von CREB besteht. Tatsächlich führten Rolipram und Tautomycin in Reportergen-Assays auch zur verstärkten Aktivierung eines CREB-abhängigen Promotors. Die TNFa-Produktion wurde in anderer Weise durch die eingesetzten Modulatoren verändert. Da Rolipram die LPS-stimulierte Produktion von TNFa vollständig inhibierte, wohingegen Tautomycin die TNFa-Produktion verstärkte, war dies ein zusätzlicher Hinweis darauf, dass die Regulation von IL-1b und TNFa differenziert voneinander erfolgt. Durch den Einsatz von Tautomycin wurden sowohl die IL-1b- als auch die TNFa-Produktion verstärkt, wobei der PP1-Inhibitor jedoch die Produktion von IL-6 und NO vollständig unterdrückte. Die Aktivität der PP1 scheint daher es sentiell für die Produktion von NO und IL-6 zu sein. NO und IL-6 werden zwar erst relativ spät nach LPS-Stimulierung gebildet, doch lassen die vorliegenden Ergebnisse vermuten, dass die PP1 erst ab 12 Stunden nach LPS-Stimulierung in aktivierter Form vorliegt und dies im Zusammenhang mit der negativen Regulation von IL-1b stehen könnte. Die vielfältigen Effekte der PDE4 und der PP1 auf die Regulation und Produktion von IL-1b, TNFa, IL-6 und NO im Rahmen dieser Arbeit dokumentieren deutlich die Komplexität der intrazellulären Signaltransduktionswege nach LPS-Aktivierung.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
A positive feature of the proinflammatory cytokines IL-1b, TNFa und IL-6 is the regulation of processes within the immune defense. These substances are produced by several cells, among them macrophages, which are activated by the contact with the lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria. A persistent and enforced production of these inflammatory mediators can perform the development of chronical inflammatory diseases. Therefore it is of a central meaning to understand the regulation of cytokine production. With this knowledge it will perhaps be possible to create new therapeutica for the successful treatment of these diseases. The expression-induction of the IL-1b-gene in LPS-stimulated macrophages is rapid but transient. Earlier experiments of the research group could show that a negative regulation of IL-1b in murine macrophages starts only after 8 to 12 hours after LPS-activation. This effect was mainly regulated at the level of transcription. In the present thesis the mechanisms of this control in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages were investigated in a closer manner. Some hints in literature indicated that this control could be performed in the protein-kinase A (PKA) pathway. Within this pathway cyclic adenosine monophosphate (cAMP) plays an important role. Therefore exogenic cAMP was set in as a modulator of the PKA-pathway in first experiments. The negative regulation of IL-1b, which occurred apparently for the first time between 8 and 12 hours after LPS-stimulation, could be released by the addition of exogenic cAMP. The accumulation of mRNA and the production of IL-1b were extremely enhanced. The meaning of further, possibly important regulation points for the production of IL-1b within the PKA-pathway was investigated by the usage of specific inhibitors. By using rolipram, a specific inhibitor of phosphodiesterase (PDE) 4, which controls the intracellular cAMP-level, the LPS-induced negative regulation of IL-1b was released after 12 hours while the accumulation and production of IL-1b-mRNA were significantly enhanced. Furthermore it was supposed that proteinphosphatase (PP) 1, which phosphorylates the transcription factor cAMP response element binding protein (CREB), could also have an important control function on the IL-1b-production in the PKA-pathway. Comparable to the effects caused by rolipram tautomycin released the negative regulation of IL-1b starting 12 hours after LPS-stimulation and enhanced IL-1b-production as well as the accumulation of the mRNA. Beside this the enzymes PDE4 and PP1 seem also to participate in the regulation of IL-1b-production on the level of promotor-activity how it could be shown by transfection experiments when using IL-1b-promotor-reportergene-constructs. In the course of this thesis it became apparent that the genetic sequence between the enhancer and the minimal promotor of the IL-1b-gene is possibly essential for the negative regulation of IL-1b. Because the meaning of the PKA-activatable transcription factor CREB for the IL-1b-production was stressed multiple times in literature, it should be investigated more in detail, if a causal connection exists between the release of the negative regulation of IL-1b and the activation state of CREB. In fact rolipram and tautomycin, both, led to an enhanced activation of CREB-depending promotors in reportergene-assays. The production of TNFa was effected in another manner by the used modulators. Because rolipram inhibited the LPS-stimulated production of TNFa completely, whilst tautomycin enhanced the TNFa-production, this could be interpreted as an additional hint, that the regulation of IL-1b and TNFa occurs independently. By the usage of tautomycin the production of IL-1b- was enhanced as well as the production of TNFa, but the production of IL-6 und NO were completely suppressed at the same time. The activity of PP1 seems therefore to be essential for the production of NO and IL-6. NO and IL-6 are produced relative lately after LPS-stimulation, but after the present experiments it can be supposed that PP1 is active only after 12 hours of LPS-stimulation. This effect could have a meaning in the context with the negative regulation of IL-1b. The multiple effects of PDE4 and PP1 on the regulation and production of IL-1b, TNFa, IL-6 and NO in the context of this thesis document apparently the complexity of intracellular signaltransduction pathways after LPS-activation.English
Uncontrolled Keywords: Macrophages, murine, lipopolysaccharide, immune system, interleukines, nitrate monoxide, phosphodiesterase 4, proteinphosphatase 1
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Macrophages, murine, lipopolysaccharide, immune system, interleukines, nitrate monoxide, phosphodiesterase 4, proteinphosphatase 1English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:52
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000727
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-7272
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Advisors: Nixdorff, Prof. Dr. Kathryn
Refereed: 28 October 2005
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/727
Export:

Actions (login required)

View Item View Item