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High Efficiency Gene Correction in Hematopoietic Cells by Donor Template-free CRISPR/Cas9 Genome Editing

Sürün, Duran :
High Efficiency Gene Correction in Hematopoietic Cells by Donor Template-free CRISPR/Cas9 Genome Editing.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2018)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: High Efficiency Gene Correction in Hematopoietic Cells by Donor Template-free CRISPR/Cas9 Genome Editing
Language: English
Abstract:

A significant fraction of inherited monogenic disorders are caused by patient-specific mutations dispersed over the entire locus of the affected gene. Although correcting these mutations by introducing healthy gene copies into the genome of the diseased cells proved effective in several clinical gene therapy trials and with more advanced vectors safety and efficacy could be improved, insertional mutagenesis and unregulated expression of genes deprived of their endogenous control elements remains a concern when using randomly integrating vectors. As has been shown repeatedly in clinical trials random vector insertions are susceptible to epigenetic silencing and can cause cancer by the activation of adjacent proto-oncogenes.

The development of genome editing tools capable of modifying any prespecified genomic sequence with unprecedented accuracy opened up a wide range of new possibilities in gene manipulation including targeted gene repair. In particular, CRISPR/Cas9 system, a prokaryotic adaptive immune system and its swift repurposing for genome editing was widely adopted as the hitherto simplest genome editing tool. In combination with a single guide RNA (sgRNA) the Cas9 endonuclease generates DNA double strand breaks (DSBs) at prespecified genomic loci that are repaired either by homology directed repair (HDR) or nonhomologous end joining (NHEJ).

Correction of human disease mutations by this technology has been thus far largely based on homologous recombination requiring an exogenous donor template along with RNA guided (gRNA) Cas9 endonucleases (RGNs). In most applications, RGNs and templates were delivered to the diseased cells by electroporation of several plasmids each expressing one of the functional components needed for targeted gene modification. However, transducing the functional components required for homology directed repair (HDR) on different plasmids and considering that electroporation is quite harmful to the target cells, only a small fraction of the cells survive transfection and even fewer retain all functional components. As a result, the number of gene corrected cells is usually quite low and reduced even further by the inherent bias of the cell's double strand break (DSB) machinery towards NHEJ.

This thesis explores the efficiency of gene repair by NHEJ in hematopoietic cells harboring patient specific point mutations in the Cytochrome b-245 heavy chain gene (CYBB) whose inactivation causes chronic granulomatous disease (X-CGD), - a life-threatening immunodeficiency disorder. Although in contrast to HDR, NHEJ is error prone, the present work was based on the theoretical assumption that about, one-third of the insertions/deletions (indels) associated with NHEJ should restore the open reading frame (ORF) disrupted by a particular disease mutation. This would lead to a significant number of ORF reconstitutions of which some, depending on the position and type of the original mutation, should either completely or partially recover protein function. Moreover, donor template free delivery of RGNs on one rather than multiple expression vectors by lentiviral infection was expected to improve gene repair efficiencies and to reduce toxicity of gene transduction.

In initial experiments designed to determine the efficiency of gene repair by NHEJ 32D hematopoietic cells expressing four different EGFP reporter transgenes harboring N-terminal frameshift mutations were nucleofected each with Cas9 and corresponding sgRNAs. Consistent with previous genome editing protocols involving transfection, gene repair efficiency was low, ranging from 2.3% to 5.5%.

Similar testing was performed in human PLB-985 leukemia cells expressing one copy of a mutationally inactivated EGFP reporter (mEGFP). However, to increase transduction rates and ensure transient RGN expression, the RGNs were delivered by integration defective lentiviruses (IDLVs). Unlike transfection IDLV delivery of RGNs yielded high on-target mutation rates leading to mEGFP repair rates of up to 27%. Collectively, the results demonstrate that mEGFP repair efficiency improved by one order of magnitude after changing the RGN delivery protocol from plasmid nucleofection to IDLV infection.

This strategy was tested further in PLB cells harboring bona fide disease mutations. For this, four X-CGD-patient specific CYBB mutations including two frameshift, one nonsense and one missense mutation were individually transduced into CYBB null PLB cells (XCGD-PLB). While subsequent delivery of the corresponding RGNs effectively repaired the frameshift mutations in up to 10% of the treated cells, the repair efficiency of the nonsense and missense mutations was with less than 2% rather ineffective.

As about 20 - 25% of most inherited blood disorders are caused by frameshift mutations, the results of this thesis suggest that up to a quarter of all patients suffering from monogenic blood disorders could benefit from a gene therapy employing personalized, donor-template free RGNs.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Ein signifikanter Anteil hereditärer, monogenetischer Erkrankungen wird durch patientenspezifische Mutationen verursacht, die über den gesamten Locus des betroffenen Gens verteilt sind. Obwohl sich in mehreren klinischen Studien die Korrektur dieser Mutationen durch die Einführung gesunder Genkopien in das Genom der erkrankten Zellen bewährt hat und mit fortschrittlicheren Vektoren die Sicherheit und Wirksamkeit verbessert werden kann, bleibt die Insertionsmutagenese und die unregulierte Expression von Genen außerhalb des Einflusses ihrer endogenen Kontrollelemente ein Problem bei der Verwendung von zufällig integrierenden Vektoren. Wie in klinischen Studien wiederholt gezeigt wurde, sind diese Vektoren anfällig für epigenetisches Silencing (Gen-Stilllegung) und können durch Aktivierung benachbarter Protoonkogene Krebs verursachen. Die Entwicklung von Genom-Editierungs-Technologien, die in der Lage sind, jede vorher festgelegte genomische Sequenz mit bisher unerreichter Präzision zu modifizieren, eröffnete eine breite Palette neuer Möglichkeiten in der Genmanipulation einschließlich gezielter Genreparatur. Insbesondere das prokaryotische adaptive Immunsystem CRISPR/Cas9, fand nach seiner eleganten Umfunktionierung zur Editierung doppelsträngiger DNA wurde als das bisher einfachste Genom-Editierwerkzeug breite Akzeptanz in der wissenschaftlichen Gemeinschaft. In Kombination mit einer einzigen guide RNA (sgRNA) erzeugt die Cas9-Endonuklease DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) an vordefinierten genomischen Loci. Diese DSB können entweder durch Homologie-gerichtete Reparatur (HDR) oder nicht-homologe Verbindung der Strangenden (NHEJ) repariert werden. Die Korrektur menschlicher Krankheitsmutationen durch diese Technologie basierte bislang weitgehend auf Homologie-gerichtete Reparatur, die neben RNA-geführten (gRNA) Cas9-Endonukleasen (RGNs) eine exogene homologe Donor-Matrize erfordert. In den meisten Anwendungen wurden RGNs und Matrizen durch Elektroporation in die erkrankten Zellen eingebracht, die auf mehreren Plasmiden kodiert sind, welche jeweils eine der funktionellen Komponenten exprimiert, die für eine gezielte Genmodifikation benötigt werden. Aufgrund dessen, dass die für die Homologie-gerichtete Reparatur (HDR) erforderlichen Komponenten auf verschiedenen Plasmiden liegen und die Elektroporation für die Zielzellen ziemlich schädlich ist, überlebt nur ein kleiner Teil der Zellen die Transfektion und noch weniger beinhalten alle funktionellen Komponenten für die HDR. Infolgedessen ist die Anzahl genkorrigierter Zellen in der Regel recht niedrig und wird durch die inhärente Bevorzugung von NHEJ seitens der Doppelstrangbruch-Maschinerie in Stammzellen noch weiter reduziert. In dieser Arbeit wird die Effizienz der Genreparatur durch NHEJ in hämatopoetischen Zellen mit patientenspezifischen Punktmutationen im Cytochrom b-245-Gen (CYBB) untersucht, dessen Inaktivierung die lebensbedrohliche Immunschwächekrankheit chronische Granulomatose (X-CGD) verursacht. Obwohl die NHEJ im Gegensatz zu HDR fehleranfällig ist, basierte die vorliegende Arbeit auf der theoretischen Annahme, dass ungefähr ein Drittel der mit NHEJ assoziierten Insertionen/Deletionen (Indels) den korrekten Leserahmen (ORF) wiederherstellen werden, der initial durch eine bestimmte Krankheitsmutation verschoben war. Dies würde zu einer signifikanten Anzahl von ORF-Rekonstitutionen führen, von denen einige, abhängig von der Position und Art der ursprünglichen Mutation, entweder die Proteinfunktion vollständig oder teilweise wiederherstellen sollten. Darüber hinaus wurde erwartet, dass die Donor-Matrize-freie Abgabe von RGNs auf einem statt von mehreren Expressionsvektoren durch lentivirale Infektion die Effizienz der Genreparatur verbessern und die Toxizität der Gentransduktion verringert. Beim ersten Experimenten zur Bestimmung der Effizienz der Genreparatur durch NHEJ wurden die 32D hämatopoetische Zellen, die vier verschiedene EGFP-Reportertransgene mit N-terminalen Frameshift-Mutationen exprimierten, jeweils mit Cas9 und entsprechenden sgRNAs nukleofektiert. In Übereinstimmung mit früheren Genom-Editierprotokollen, die eine Transfektion beinhalten, war die Effizienz der Gen-Reparatur gering und lag zwischen 2,3% und 5,5%. Ähnliche Tests wurden in humanen PLB-985 Leukämiezellen durchgeführt, die eine Kopie eines mutationsinaktivierten EGFP-Reporters (mEGFP) exprimierten. Um die Transduktionsraten zu erhöhen und transiente RGN-Expression zu gewährleisten, wurden die RGNs durch Integrations-defekte Lentiviren (IDLVs) transduziert. Im Gegensatz zur Nucleofektion ergab die IDLV-Infektion von RGNs eine hohe On-Target-Mutationsraten, was zu mEGFP-Reparaturraten von bis zu 27% führte. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass sich die mEGFP-Reparatureffizienz um eine Größenordnung verbessert hat, nachdem das RGN Transduktionsprotokoll von Plasmid-Nukleofektion zu IDLV-Infektion geändert wurde. Anschließend wurde die Strategie bei der hereditären septischen Granulomatose (X-CGD) die durch Mutationen im Cytochrome b-245 beta polypeptide (CYBB) Gen entstehen, in PLB985 Zellen getestet. Dazu wurden vier X-CGD-Patientenspezifische CYBB-Mutationen mit zwei Frameshift-, einer Nonsense- und einer Missense-Mutation einzeln in CYBB-Null-PLB-Zellen (XCGD-PLB) eingebracht. Während der nachfolgenden Transduktion der Zellen mit den entsprechenden IDLV-RGNs, wurden effektiv bis zu 10% die Frameshift-Mutationen korrigiert. Die Reparatureffizienz bei den Nonsense- und Missense-Mutationen war mit weniger als 2% jedoch eher ineffektiv. Da etwa 20 – 25% der meisten vererbten Bluterkrankungen durch Frameshift-Mutationen verursacht werden, legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass ein Viertel aller an monogenen Blutkrankheiten leidenden Patienten von einer Gentherapie profitieren könnten, die personalisierte, Donor-Template-freie RGNs verwendet.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Stem Cell and Developmental Biology
10 Department of Biology > Molecular Genetics
Date Deposited: 23 Feb 2018 10:07
Last Modified: 23 Feb 2018 10:07
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-72476
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina and von Melchner, Prof. Dr. Harald
Refereed: 6 February 2018
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7247
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