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Metabolic engineering approaches reveal widespread physiological functions of membrane lipids for Saccharomyces cerevisiae

Degreif, Daniel :
Metabolic engineering approaches reveal widespread physiological functions of membrane lipids for Saccharomyces cerevisiae.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2018)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Metabolic engineering approaches reveal widespread physiological functions of membrane lipids for Saccharomyces cerevisiae
Language: English
Abstract:

The lipid composition of biological membranes can differ significantly between organisms and even between organelles of the same cell in terms of lipid compounds and specific ratios of lipid classes. Referring to this, every membrane features a characteristic lipid composition that is thought to regulate its physicochemical properties and cellular function by providing lipid environments supporting the integrity of membrane-localized protein machinery and membrane-associated processes. Chapter I gives a brief overview of the interlinkage between the chemical nature of membrane lipids, the structural and functional organization as well as the physicochemical properties of lipid bilayers and their influence on membrane-embedded proteins. Studies to gain detailed knowledge on how membrane lipid composition influences the physiology of cells and regulates cellular processes require tools to manipulate lipid composition in vivo. By employing metabolic engineering approaches based on titratable gene expression tools, sets of Saccharomyces cerevisiae strains in which membrane lipid composition is under experimental control were engineered. The study described in Chapter II addresses OLE1, encoding for the sole fatty acid desaturase of budding yeast, to control the extent of acyl unsaturation of fatty acids incorporated in phospholipids. This approach revealed cellular roles for the physical state of cell membranes, so called membrane fluidity, on yeast flocculation and hypoxic growth. It is shown, how the endogenous lipid homeostasis machinery of budding yeast is adapted to carry out a broad response to oxygen limitation (hypoxia) and how it activates a non-canonical yeast flocculation pathway involving FLO1, which encodes for cell wall glycoproteins that mediate cell-cell-interactions by binding cell wall mannose residues of adjacent cells. In Chapter III, the previously generated strain in which expression of OLE1 is under experimental control was used as a cellular platform to assay the activity of heterologously expressed stearoyl-CoA desaturases (SCDs). Putative SCDs from human pathogens T. brucei and T. cruzi were functionally expressed in S. cerevisiae, thereby additionally confirming their SCD activity in vivo. The presented assay might also provide a tool to screen for inhibitors of SCDs, which are interesting drug targets in the treatment of bacterial and parasitic infections in humans. The study presented in Chapter IV addresses ERG9, an essential gene involved in the ergosterol biosynthetic pathway and used a metabolic engineering approach to achieve control over the total sterol biosynthetic activity of the cell. Cells that allowed for manipulating the native sterol homeostasis were employed to unveil physiological effects of ergosterol and total sterol depletion on the cell’s general viability as well as on fundamental membrane associated processes such as protein sorting and endo- and exocytosis. By combining this metabolic engineering approach and the powerful method of marker-free CRISPR/Cas9-mediated gene tagging, it was possible to establish a cellular system for investigating the impact of sterol depletion on the lateral distribution pattern of lipid-raft associated GFP-tagged membrane proteins within the plasma membrane of yeast. Chapter V introduces a novel set of all-in-one constitutive and inducible CRISPR/Cas9 vectors that allow for a very easy and highly convenient application of the technology in S. cerevisiae. The simplicity of the inducible system is based on the possibility of introducing a desired gRNA targeting sequence with homologous recombination-mediated assembly of overlapping single-stranded oligonucleotides. The inducible Cas9 expression approach also introduces the novel concept of chronologically separating the cloning procedure from the actual genome editing step by preloading cells with an all-in-one CRISPR/Cas9 plasmid. This way, CRISPR/Cas9-supported genome editing can be obtained with high efficiency and effectivity by just transforming a desired preloaded target strain with donor DNA to be genomically integrated without the need of co-introducing any of the CRISPR system components. These novel CRISPR/Cas9 systems will help to overcome limitations often observed for challenging metabolic and genetic engineering approaches that can be e.g. used for following studies to reveal physiological roles of membrane lipids for budding yeast.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Biologische Membranen unterschiedlicher Organismen, aber auch von Zellen des gleichen Organismus und sogar Organellen der gleichen Zelle können sich hinsichtlich ihrer spezifischen Lipidzusammensetzung deutlich voneinander unterscheiden. Jede Membran weist dabei eine charakteristische Lipidkomposition auf, die sowohl die physikochemischen Eigenschaften als auch die biologische Funktion dieser Membran maßgeblich bestimmt, indem spezifische Lipid-Umgebungen zur Verfügung gestellt werden, die für die Integrität der Membran-lokalisierten Protein-Maschinerie und Membran-assoziierter zellulärer Prozesse essentiell ist. Kapitel I gibt einen kurzen Überblick über die chemische Struktur prominenter Membranlipide, die damit eng verbundenen physikochemischen Eigenschaften membranärer Lipid-Bilayer, sowie die Beeinflussung der Funktion Membran-inkorporierter Proteine durch diese Membrancharakteristika. Studien zur Aufklärung des Einflusses der Lipidkomposition auf die allgemeine Zellphysiologie sowie Regulation zellulärer Prozesse benötigen effiziente Methoden zur Manipulation der Lipidkomposition in vivo. Metabolic Engineering Ansätze in Verbindung mit Methoden zur Regulation von Genexpression wurden dabei genutzt, um Saccharomyces cerevisiae Stämme zu generieren, die eine gezielte und experimentell kontrollierbare Veränderung ihrer Lipidkomposition erlauben. Die in Kapitel II beschriebene Studie adressiert dabei die einzige in S. cerevisiae vorkommende Fettsäure-Desaturase (codiert durch OLE1), um experimentelle Kontrolle über den Sättigungsgrad Phospholipid-inkorporierter Fettsäuren und somit der Gesamtheit des Hefelipidoms zu erlangen. Dieser Ansatz offenbarte zelluläre Funktionen eines wichtigen physikalischen Membranparameters, der sogenannten Membranfluidität, für Prozesse wie die Ausbildung eines Flockulierungsphänotypes sowie Anpassung an hypoxische Wachstumsbedingungen. Die präsentierte Studie zeigt, wie die Hefe-endogene Lipid-Homöostase-Maschinerie dazu genutzt wird, eine umfangreiche zelluläre Antwort auf Sauerstoff-limitierende Umgebungsbedingungen (Hypoxie) einzuleiten und Zell-Zell-Aggregation in Form von Flo1p-vermittelter Flockulierung zu induzieren. Dieser Aggregationsphänotyp basiert dabei auf der von Flo1p als Zellwand-verankertes Glykoproteins vermittelten Fähigkeit zur spezifischen Bindung der von der Zellwand benachbarter Hefezellen präsentierten Mannosylseitenketten. Die in Kapitel III beschriebene Studie nutzt die zuvor generierten Stämme mit experimentell kontrollierbarer OLE1-Expression als zelluläre Plattform zum Nachweis der enzymatischen Aktivität heterolog exprimierter Stearoyl-CoA-Desaturasen (SCDs). Mutmaßliche SCDs der beiden humanpathogenen Parasiten T. brucei und T. cruzi wurden dabei funktional in S. cerevisiae exprimiert und auf diese Weise gleichsam ihre Stearoyl-CoA Desaturase-Aktivität in vivo nachgewiesen. Das vorgestellte Assay eignet sich daher ebenfalls als Werkzeug zum Hefe-basierten Screening von SCD-Aktivität inhibierenden Substanzen, die als vielversprechende Medikamente zur Behandlung bakterieller und parasitärer Infektionen des Menschen gelten und teilweise bereits Einsatz finden. Kapitel IV beschreibt die Nutzung eines ERG9-adressierenden Metabolic Engineering Ansatzes, um experimentelle Kontrolle über die Sterol-Biosythese-Aktivität von S. cerevisiae zu erlangen. ERG9 codiert für eine Squalen-Synthase, die als sogenanntes „Gate-Keeper Enzym“ den Metabolit-Flux in Richtung des linearen Ergosterol-Biosyntheseweges zu regulieren in der Lage ist. Zellen mit manipulierbarer Sterol-Homöostase und verringertem Ergosterol-Gehalt wurden dazu genutzt, um den Einfluss von Membransterolen auf die generelle Zell-Viabilität aber auch auf fundamentale Zellmembran-assoziierte Prozesse wie Protein Sorting sowie Endo- und Exocytose zu untersuchen. Durch Kombination dieses Metabolic Engineering Ansatzes und CRISPR/Cas9-vermittelter Marker-freier Genom-Editierung war es zudem möglich, ein zelluläres System zur Untersuchung des Einflusses einer Verarmung von Membransterolen auf das laterale Verteilungsmuster Lipid-Raft-assoziierter GFP-getaggter Membranproteine in der Plasmamembran der Bäckerhefe zu etablieren. In Kapitel V wird ein neuartiges, induzierbares oder konstitutives all-in-one CRISPR/Cas9-Plasmidsystem zur einfachen und komfortablen Anwendung dieser Technologie in S. cerevisiae vorgestellt. Die Einfachheit des vorgestellten induzierbaren Systems liegt dabei in der Möglichkeit zur bequemen Einklonierung einer gewünschten, in der gRNA codierenden Sequenz enthaltenen Protospacer-Sequenz begründet. Die Einführung der Protospacer-Sequenz beruht dabei alleine auf einer wenig arbeitsintensiven homologen Rekombinations-vermittelten Assemblierung von einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden in vivo. Gleichsam führt das vorgestellte induzierbare CRISPR/Cas9-System, mit dem zu modifizierende Zellen vor dem eigentlichen Genom-Editierungsschritt vorgeladen werden können, ein neuartiges Konzept der chronologischen Separierung essentieller Arbeitsschritt (Plasmidklonierung, Genom-Editierung), gepaart mit hoher Transformationseffizienz sowie einfacher Anwendbarkeit, ein. Eine hohe Effizienz und Effektivität der Genom-Editierung wird dadurch gewährleistet, dass Komponenten des CRISPR/Cas9-Systems sowie die genomisch zu integrierende Donor-DNA zeitlich getrennt in die Zelle eingeschleust werden können, wodurch eine multiplikative Verknüpfung unvorteilhafter Einzeltransformationseffizienten umgegangen wird. Dieses neuartige Plasmid-basierte CRISPR/Cas9-System eignet sich folglich dazu, Transformationseffizienz-bedingte Limitierungen von Metabolic und Genetic Engineering Ansätzen zu überwinden, die wiederum für nachfolgende Studien zur Aufklärung physiologischer Funktionen von Membranlipiden von Nutzen sind.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Yeast Membrane Biology
Date Deposited: 02 Feb 2018 13:33
Last Modified: 02 Feb 2018 13:33
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-72210
Referees: Bertl, Prof. Dr. Adam and Gerhard, Prof. Dr. Thiel
Refereed: 25 January 2018
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7221
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