TU Darmstadt / ULB / TUprints

Mining and analysis of new viral potassium channel proteins A structure and function study of new viral potassium channels from marine picoplankton and chlorella viruses

Siotto, Fenja :
Mining and analysis of new viral potassium channel proteins A structure and function study of new viral potassium channels from marine picoplankton and chlorella viruses.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2018)

[img]
Preview
Text
Dissertation_Siotto_2018.pdf
Available under Only rights of use according to UrhG.

Download (16MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Mining and analysis of new viral potassium channel proteins A structure and function study of new viral potassium channels from marine picoplankton and chlorella viruses
Language: English
Abstract:

Many viruses, which infect algae, code for small membrane proteins with the characteristics of potassium channels. The peculiarity of these channels is that they have a monomer size of less than 100 amino acids. The structural simplicity and functional robustness of these miniature channels makes viral K+ channels very good model systems for understanding the basic molecular architecture of potassium channels. To learn more about structure/function correlates in these simple channel proteins I tried to generate a library of channel sequences. For this purpose, I searched for channel orthologues in environmental water samples and DNA databases. Here I present some interesting new viral potassium channels from salt and fresh water viruses. Structural prediction algorithms indicate that the new channels from salt water viruses have the canonical α-helix folds, which are typical for the pore module of all known K+ channels. However, structural prediction algorithms failed to identify the expected transmembrane domains flanking the potassium channel pores. The fact that electrophysiological measurements confirmed an activity of these channels suggests that the transmembrane organization of these proteins is achieved in a different manner than in other K+ channels. The newly identified viral K+ channels have unique functional properties: Two genes encode proteins, Kmpv12T and Kmpv1, of only 78 or 79 amino acid per unit, respectively. These are the smallest known K+ channels and this small size is presumably close to the absolute minimal size for a K+ channel. Both could be identified as functional channels by a combination of heterologous expression and electrophysiological measurements. In addition to these extra small channels from Micromonas sp. viruses also the function of Kmpvsp1 was confirmed. This channel exhibits unlike all other viral channels a pronounced inward rectification and some permeability to Na+. Kbpv1 from a Bathycoccus sp. virus and KotvRT from a Ostreococcus sp. virus could be identified as functional and selective potassium channels. KotvRT exhibits a steep voltage dependend Ba2+ and Cs+ block, which is similar to the Cs+ block of KcvNTS. Two new channels were also isolated from fresh water Chlorella viruses. One of them, KcvGLND is from an evolutionarily interesting hybrid virus, which contains genes of SAG viruses and Pbi viruses. KcvNH is a channel from the KcvATCV-1 family, with interesting structure-function relations. Some proteins like Kmpv12T have a channel-like structure but fail to generate a conductance after expression in HEK293 cells. After investigating the cellular distribution of GFP-tagged proteins we found that all the channels, which were positively identified in HEK293 cells in patch clamp recordings, were sorted into the secretory pathway and presumably from there to the plasma membrane. The channels which failed to generate currents in the plasma membrane of HEK293 cells were on the other hand predominantly sorted into the mitochondria or remained unsorted in the cytosol. When Kmpv12T was synthesized as representative for the latter channels in vitro and reconstituted into planar lipid bilayers it also generated typical potassium channel activity. Collectively, the data show that the majority of newly identified viral K+ channels generated, in spite of non-canonical structural features such as a small size and an unusual transmembrane domain architecture, potassium channel function. Some of the new channels exhibit an unusual sorting to the mitochondria. The finding that some of these proteins generate channel activity in planar lipid bilayers suggests that also these proteins are functional K+ channels.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Viele Viren die Algen als Wirt nutzen codieren für kleine Membranproteine mit den Eigenschaften von Kaliumkanälen. Das Besondere an diesen Kanälen ist, dass die Monomere aus weniger als 100 Aminosäuren bestehen. Durch die einfache Struktur und ihre funktionale Robustheit sind sie ein sehr gutes Modellsystem um die grundlegende molekulare Struktur von Kaliumkanälen zu verstehen. Um mehr über Struktur-/Funktionskorrelation in diesen einfachen Kanalproteinen zu erfahren, habe ich begonnen eine Bibliothek von Kanalsequenzen zu erstellen. Im Rahmen dessen habe ich Gewässerproben nach neuen Kanälen gescreent und in Datenbanken nach Orthologen gesucht. Hier stelle ich nun einige interessante neue virale K+-Kanäle aus Salz- und Süßwasserviren vor. Algorithmen zu Strukturvorhersage zeigen, dass die neuen Kanäle aus Salzwasserviren die kanonischen α-Helixmotive aufweisen, die für das Porenmodul aller bekannten K+-Kanäle typisch sind. Allerdings wurden die erwarteten Transmembrandomänen, die die Kaliumkanalporen flankieren, von den Vorhersagealgorithmen nicht identifiziert. Die Tatsache, dass elektrophysiologische Messungen eine Aktivität dieser Kanäle bestätigten, deutet darauf hin, dass die Transmembranorganisation dieser Proteine in anderer Weise als in den bekannten K+-Kanälen erreicht wird. Die neu gefundenen viralen K+-Kanäle haben einzigartige funktionelle Eigenschaften: Zwei der Gene kodieren für Proteine, Kmpv12T und Kmpv1, die nur 78 bzw. 79 Aminosäuren pro Untereinheit groß sind. Dies sind die kleinsten bekannten Kaliumkanäle und vermutlich nahe am kleinstmöglichen Kaliumkanal. Beide konnten als funktionelle Kanäle durch eine Kombination von heterologer Expression und elektrophysiologischen Messungen nachgewiesen werden. Neben diesen besonders kleinen Kanälen von Micromonas sp. Viren konnte auch die Funktion von Kmpvsp1 bestätigt werden. Dieser Kanal zeigt im Gegensatz zu allen anderen Viruskanälen eine ausgeprägte Einwärtsgleichrichtung und eine gewisse Leitfähigkeit für Na+. Kbpv1 von einem Bathycoccus sp. Virus und KotvRT aus einem Ostreococcus sp. Virus konnten ebenfalls als selektive Kaliumkanäle nachgewiesen werden. KotvRT zeigt einen steilen spannungsabhängigen Ba2 +- und Cs+-Block, der ähnlich dem Cs+-Block von KcvNTS ist. Zwei weitere neue Kanäle wurden aus Süßwasser-Chlorella-Viren isoliert. Einer von ihnen ist KcvGLND. Dieser stammt aus einem evolutionär interessanten Hybridvirus, der Gene von SAG-Viren und Pbi-Viren enthält. KcvNH ist ein Kanal aus der KcvATCV-1-Familie mit interessanten Struktur-Funktions-Beziehungen. Einige Proteine wie Kmpv12T haben eine kanalartige Struktur, aber dennoch keine Leitfähigkeit nach Expression in HEK293-Zellen gezeigt. Nach der Untersuchung der zellulären Verteilung von GFP-markierten Proteinen haben wir festgestellt, dass alle Kanäle die in HEK293-Zellen durch Patch-Clamp-Messungen positiv identifiziert wurden, in den sekretorischen Weg und von dort vermutlich zur Plasmamembran transportiert wurden. Die Kanäle, die keine Ströme in der Plasmamembran von HEK293-Zellen gezeigt haben, wurden hingegen überwiegend in die Mitochondrien sortiert oder unsortiert im Cytosol belassen. Repräsentativ für die zu letzte genannten Kanäle wurde Kmpv12T in vitro synthetisiert und in planaren Lipidbilyer rekonstituiert. Hier erzeugte er auch eine typische Kaliumkanalaktivität. Gemeinsam zeigen die Daten, dass die Mehrheit der neu identifizierten viralen K+-Kanäle trotz nicht-kanonischer Strukturmerkmale, sowie einer geringen Größe und einer ungewöhnlichen Transmembran-Domänenarchitektur Kaliumkanal-Funktion zeigen. Einige der neuen Kanäle zeigen eine ungewöhnliche Sortierung in die Mitochondrien. Die Kanalaktivität bei den planaren Lipidbilayer Versuchen deuten darauf hin, dass einige dieser Proteine funktionelle K+-Kanäle sind.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 10 Jan 2018 15:27
Last Modified: 10 Jan 2018 15:51
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-71652
Referees: Thiel, Prof. Dr. Thiel and Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed: 18 December 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7165
Export:
Actions (login required)
View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year