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Resection-dependent canonical non-homologous end-joining induces genomic rearrangements

Anugwom (geb. Biehs), Ronja :
Resection-dependent canonical non-homologous end-joining induces genomic rearrangements.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Resection-dependent canonical non-homologous end-joining induces genomic rearrangements
Language: English
Abstract:

DNA double-strand breaks (DSBs) are the main threat to genomic integrity. The majority of DSBs are repaired by canonical non-homologous end-joining (c-NHEJ), where the two DSB ends are rejoined with minimal processing. Some studies suggest that the rejoining of DSBs by c-NHEJ can be error-prone by causing sequence alterations and/or the misrejoining of two separate DSBs. Such genomic rearrangements are a driving force in carcinogenesis. However, it remains an ongoing discussion as to how such rearrangements arise, as other studies associate genomic rearrangements with alternative end-joining (alt-EJ) and factors favoring resection. During alt-EJ the involvement of resection results in the loss of genetic information. However, there is evidence that alt-EJ mechanisms only play a role in human cells, which are deficient for certain repair proteins. This is the case in combination with genetic defects or in tumor cells. Thus, it remains unclear how mutagenic end-joining, which results in genomic rearrangements, operates and is regulated in wild-type human cells. To answer this question, mutagenic end-joining repair was investigated in this study by combining a reporter assay with other molecular biological assays. This reporter assay monitors the misrejoining of two 3.2 kilobase distant DSB ends under the loss of the intervening fragment. In addition, the sequence alterations at the misrejoined break sites were analyzed and overall repair was investigated. Furthermore, two approaches were taken to understand the circumstances under which error-prone end-joining is employed in wild-type human cells: the misrejoining of DSBs was compared between different reporter assays and the interactions of proteins involved in this pathway were analyzed. The results of this study show that distant DSB ends are misrejoined by a hitherto undescribed slow repair mechanism, which is specific for the G1 phase of the cell cycle. These misrejoined break sites are frequently associated with sequence alterations, especially small deletions (less than 50 nucleotides). These deletions are the result of limited resection. Surprisingly, the DSB ends remain protected by the key c-NHEJ factor KU during this undescribed repair mechanism. This feature distinguishes this end-joining process from all previously described pathways involving resection. Indeed, the absence of factors such as KU or the anti-resection factor 53BP1 results in increased genomic rearrangements by alt-EJ. Hence, in this novel repair pathway, c-NHEJ factors are pivotal in ensuring resection remains limited. Resection-dependent c-NHEJ is initiated by the activation of the resection factor CtIP. This is achieved through damage-inducible phosphorylation by the kinase PLK3 at Ser327, Thr847, and probably additional sites. Subsequently, the phosphorylation of CtIP at Ser327 results in its interaction with the pro-resection factor BRCA1. Similar to its role in S/G2 phase, the BRCA1-CtIP interaction seems to be important to overcome the resection barrier posed by 53BP1. Resection is executed by the exonuclease EXO1. Although EXD2 and MRE11 are also involved, the endonuclease function of MRE11 is dispensable for this repair pathway, indicating that resection is conducted from the DSB end. This is a key step limiting resection since the endonucleolytic cut by MRE11 overcomes the protected or blocked DSB ends during other resection processes to generate large single-stranded DNA overhangs. Thus, the initiation and execution of resection in this novel pathway is finely tuned to ensure that resection remains limited. Strikingly, the impairment of factors involved in the initiation or execution of resection does not result in unrepaired DSBs. This indicates that a repair pathway switch occurs in their absence. Although the absence of this novel error-prone repair pathway results in less genomic rearrangements, the remaining rearrangements are associated with worse sequence alterations, including longer deletions. Importantly, the limited resection process during resection-dependent c-NHEJ produces short single-stranded DNA regions, which form intermediate structures. These structures need to be resolved by the endonuclease activity of ARTEMIS, which is dependent on its interaction with the key c-NHEJ component DNA-PKcs. Thus, once resection has taken place, both ARTEMIS and DNA-PKcs are indispensable for repair completion. The break sites are mostly misrejoined using microhomologies, and thus require the single-stranded DNA gaps to be filled-in by polymerases. POL, which is typically associated with microhomologies, acts in this novel repair pathway, but the c-NHEJ-associated polymerases POL/ are also involved. The ligation step is conducted by the c-NHEJ ligase LIG4 and not by LIG1/3, which ligate DSB ends during alt-EJ. To summarize, despite its error-prone characteristics, this novel repair pathway restricts the loss of genetic information to a minimum. This is accomplished by rejoining the break sites using microhomologies, by keeping resection limited with the help of c-NHEJ factors, and by preventing an endonucleolytic cut by MRE11. In conclusion, this study characterizes a novel G1-specific mutagenic resection-dependent c-NHEJ pathway in human cells. In addition, this study shows how protein-protein interactions influence the choice to utilize this DSB repair pathway. The occurrence of resection in combination with c-NHEJ factors is a unique feature of this repair pathway and was hitherto thought to be mutually exclusive. Furthermore, the discovery of this pathway clarifies the role of alt-EJ as a type of backup mechanisms to compensate for missing repair proteins. Hence, in the ongoing discussion of how genomic rearrangements arise, this novel repair pathway unifies the contradicting observations of other studies.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
DNA Doppelstrangbrüche (DSBs) sind die größte Gefahr für die genomische Integrität. Die Mehrheit aller DSBs wird durch die kanonische nicht-homologe Endverknüpfung (c-NHEJ) repariert, bei der die beiden Bruchenden nach minimaler Prozessierung miteinander verknüpft werden. Manche Studien suggerieren, dass c-NHEJ durch Sequenzmodifikationen und/oder die Fehlverknüpfung zweier separater DSBs fehlerbehaftet sein kann. Solche genomische Umlagerungen sind eine treibende Kraft der Karzinogenese. Allerdings bleibt die Entstehung dieser Umlagerungen ungewiss, denn andere Studien assoziieren genomische Umlagerungen mit alternativer Endverknüpfung (alt-EJ) und resektionsfördernden Faktoren. Die Beteiligung von Resektion führt während des alt-EJ zu dem Verlust genetischer Informationen. Jedoch gibt es Hinweise, dass alt-EJ in humanen Zellen nur eine Rolle spielt, wenn diese nicht über bestimmte Reparaturproteine verfügen. Dies ist bei Gendefekten und in Tumorzellen der Fall. Daher bleibt unklar, wie in humanen Wildtyp-Zellen mutagene Endverknüpfung, welche zu genomischen Umlagerungen führt, stattfindet und reguliert wird. Um diese Frage zu beantworten, wurde die mutagene Endverknüpfungsreparatur in dieser Studie mittels eines Reporter-Assays in Kombination mit anderen molekularbiologischen Analysemethoden untersucht. Dieser Reporter-Assay misst die Fehlverknüpfung zweier 3,2 Kilobasen entfernter DSB-Enden, die durch den Verlust des dazwischenliegenden Fragmentes entsteht. Zusätzlich wurden die Sequenzveränderungen an den fehlverknüpften Bruchstellen analysiert und die Gesamtreparatur untersucht. Außerdem wurden zwei Ansätze gewählt, um zu verstehen unter welchen Bedingungen fehlerbehaftete Endverknüpfung in humanen Wildtyp-Zellen stattfindet: die Fehlverknüpfung von DSBs wurde zwischen verschiedenen Reporter-Assays verglichen und Interaktionen von Proteinen, die in diesem Reparaturweg beteiligt sind, wurden analysiert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass voneinander entfernt liegende DSB-Enden durch einen bisher unbeschriebenen langsamen Reparaturmechanismus fehlverknüpft werden, der spezifisch für die G1 Phase des Zellzyklus ist. Die fehlverknüpften Bruchstellen sind häufig mit Sequenzveränderungen assoziiert, vor allem mit kurzen Deletionen (unter 50 Nukleotide). Diese Deletionen resultieren aus limitierter Resektion. Überraschenderweise werden die DSB-Enden in diesem unbeschriebenen Reparaturweg durch KU geschützt, einem Kernfaktor des c-NHEJ. Dieses Merkmal unterscheidet diesen Endverknüpfungsprozess von allen zuvor beschriebenen Reparaturwegen, bei denen Resektion involviert ist. Tatsächlich führt die Abwesenheit von KU oder des Antiresektionsfaktors 53BP1 zu vermehrten genomischen Umlagerungen durch alt-EJ. Daher sind c-NHEJ-Faktoren ausschlaggebend in diesem neuen Reparaturweg, um zu gewährleisten, dass die Resektion limitiert bleibt. Resektionsabhängiges c-NHEJ wird durch die Aktivierung des Resektionsfaktors CtIP initiiert. Dies wird mittels Phosphorylierung durch die Kinase PLK3 an Ser327, Thr849 und vermutlich weiteren Stellen erreicht. Darauffolgend interagiert das an Ser327-phosphorylierte CtIP mit dem Pro-Resektionsfaktor BRCA1. Vergleichbar zu seiner Rolle in der S/G2 Phase, scheint die BRCA1-CtIP Interaktion wichtig zu sein, um die 53BP1-Resektionsbarriere zu überwinden. Die Resektion wird von der Exonuklease EXO1 durchgeführt. Obwohl EXD2 und MRE11 auch involviert sind, ist die Endonukleasefunktion von MRE11 entbehrlich für diesen Reparaturweg, was daraufhin deutet, dass die Resektion vom DSB-Ende durchgeführt wird. Dies ist ein entscheidender Schritt um die Resektion zu limitieren, denn der endonukleolytische Schnitt durch MRE11 überwindet in anderen Resektionsprozessen geschützte oder blockierte DSB-Enden und generiert so große einzelsträngige DNA-Überhänge. Folglich ist die Initiierung und Durchführung der Resektion in diesem neuen Reparaturweg fein abgestimmt um sicherzustellen, dass die Resektion limitiert bleibt. Bemerkenswerterweise führt die Beeinträchtigung von Faktoren, die an der Initiierung oder Durchführung der Resektion beteiligt sind, nicht zu unreparierten DSBs. Dies deutet darauf hin, dass ohne diese Faktoren ein Wechsel des Reparaturweges stattfindet. Obwohl die Abwesenheit dieses neuen fehlerbehafteten Reparaturwegs in weniger genomischen Umlagerungen resultiert, sind die verbleibenden Umlagerungen mit schlimmeren Sequenzmodifikationen verbunden, inklusive längeren Deletionen. Der limitierte Resektionsprozess in diesem neuen Reparaturweg führt zu kurzen einzelsträngigen Bereichen, die intermediäre Strukturen ausbilden. Diese Strukturen müssen durch die Endonukleaseaktivität von ARTEMIS aufgelöst werden, was von ihrer Interaktion mit DNA-PKcs abhängig ist, einer Kernkomponente des c-NHEJ. Folglich sind ARTEMIS und DNA-PKcs unentbehrlich sobald Resektion stattgefunden hat. Die Bruchstellen werden zumeist unter der Verwendung von Mikrohomologien verknüpft und erfordern daher das Auffüllen der einzelsträngigen DNA-Bereiche durch Polymerasen. POL, welche mit Mikrohomologien in Verbindung gebracht wird, agiert in diesem Reparaturweg aber auch die c-NHEJ-assoziierten Polymerasen POL/ sind involviert. Der Ligationsschritt wird von der c-NHEJ Ligase LIG4 durchgeführt und nicht von LIG1/3, welche DSB-Enden während alt-EJ ligieren. Zusammengefasst beschränkt dieser neue Reparaturweg trotz seiner fehlerbehafteten Charakteristiken den Verlust von genetischen Informationen an fehlverknüpften Bruchenden auf ein Minimum. Dies wird erreicht durch die Verknüpfung der Bruchstellen unter der Verwendung von Mikrohomologien, durch die Limitierung der Resektion mithilfe von c-NHEJ Faktoren, sowie mittels der Verhinderung eines endonukleolytischen Schnitts durch MRE11. Zusammengefasst charakterisiert diese Studie einen neuen, G1-spezifischen, mutagenen, resektionsabhängigen c-NHEJ Weg in humanen Zellen. Zusätzlich zeigt die Studie, wie Protein-Protein Interaktionen die Entscheidung beeinflussen, diesen DSB-Reparaturweg zu benutzen. Die Kombination von Resektion und c-NHEJ-Faktoren ist ein einzigartiges Merkmal dieses Reparaturwegs, da bisher angenommen wurde, dass sich diese Prozesse gegenseitig ausschließen. Darüber hinaus verdeutlicht die Entdeckung dieses Reparaturweges, dass alt-EJ eine Ansammlung von Backup-Mechanismen ist, um für fehlende Reparaturproteine zu kompensieren. Folglich vereint dieser neue Reparaturweg in der fortlaufenden Diskussion wie genomischen Umlagerungen entstehen, die widersprüchlichen Beobachtungen anderer Studien.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 20 Dec 2017 08:10
Last Modified: 20 Dec 2017 08:10
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-70448
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus and Hamacher, Prof. Dr. Kay
Refereed: 13 December 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7044
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