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DNA-double strand break repair and cell cycle control of murine stem cells after exposure to ionizing radiation

Mofidi, Amir :
DNA-double strand break repair and cell cycle control of murine stem cells after exposure to ionizing radiation.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: DNA-double strand break repair and cell cycle control of murine stem cells after exposure to ionizing radiation
Language: English
Abstract:

Ionizing radiation (IR) induces a variety of DNA lesions among which DNA double strand breaks (DSBs) are biologically most significant. In somatic cells, several cellular DNA damage response (DDR) mechanisms such as cell cycle checkpoints and DSB repair pathways work in concern to handle these threats. In response to DNA damage, G1/S and G2/M checkpoints activities prevent the progression of the cells to the next cell cycle phase. This mechanism prohibits replication and division of the cells containing DSBs and provides them time for repair. In parallel to this event, DNA repair machinery repairs the DSBs. The majority of IR-induced DSBs are repaired fast via canonical non-homologous end-joining (c-NHEJ) in which DNA-PKcs is one of the core enzymes. In contrast, a sub-fraction of breaks is repaired with slow kinetics in an ATM-dependent manner. This repair pathway represents homologous recombination (HR) in G2 and resection-dependent c-NHEJ in G1 phase. In stem cells, although it is appreciated that DDR regulation is distinct from that in somatic cells, the key factors and their functional mechanisms still remain unknown. The main aim of this thesis was to understand the mechanism/s by which stem cells retain their genomic integrity. Moreover, the level of repair capacity in pluripotent and multipotent stem cells has been compared. To achieve these aims, the DDR mechanism has been characterized in mouse embryonic stem cells (ESCs) and ESC-derived neural stem cell (NSCs). Cell cycle checkpoint analysis after 2 Gy X-rays demonstrated an ineffective G1/S checkpoint arrest in NSCs, whereas, ESCs failed to prevent cell cycle progression into S phase. In both cell types, cell cycle was completely arrested by G2/M checkpoint. However, ESCs showed a prolonged G2/M arrest compared to NSCs. Analyzing DSB repair in NSCs after exposure to 10 mGy and 100 mGy X-rays revealed that the repair capacity is reduced by decreasing the radiation dose. After 10 mGy IR, the value of the IR-induced DSBs was remained constant until 4 h post IR. This is evident that the DSB repair machinery cannot be fully activated by low doses of IR. Investigation of DSB repair capacity after 2 Gy X-rays showed that wild type (WT) ESCs and NSCs have similar repair kinetics and almost all IR-induced DSBs were repaired within 6 h post IR. Inhibition of ATM impaired the slow component of DSB repair in both cell types, whereas, the fast component was not affected. Interestingly, DNA-PKcs inhibitor induced a temporary repair defect followed by an efficient repair to the background DSB levels in ESCs. In contrast, in NSCs, DSB repair was almost stalled after inhibition of DNA-PKcs. Moreover, inhibition of Rad51 impaired the DSB repair in G2-phase NSCs, whereas in ESCs, the repair kinetic was not impaired. Therefore, we asked if an alternative repair pathway provides a backup repair mechanism in DNA-PKcs- and Rad51-deficient ESCs. To address the aforementioned question, we investigated the role of alt-NHEJ pathway in ESCs and NSCs by inhibiting PARP1. Importantly, PARP1-inhibition did not influence DSB repair kinetics in WT or ATM-inhibited cells. However, inhibition of PARP1 induced an additional significant repair defect in DNA-PKcs- and Rad51-inhibited ESCs, not in NSCs. These data demonstrated that PARP1-dependent alt-NHEJ functions as a backup repair pathway for impaired c-NHEJ or HR in ESCs. It is well know that PARP1-dependent alt-NHEJ is a resection dependent pathway. Analyzing resection in G2 phase by scoring Rad51 foci displayed a higher foci level in ESCs than in NSCs. In addition, investigation of resection in G1 phase uncovered that ESCs form pRPA foci, not NSCs. Furthermore, inhibition of the proteins regulating resection in G1 phase, like PLK3, not only diminished the formation of pRPA foci but also impaired DSB repair in ESCs. Whereas, in non-pluripotent cells (NSCs or HeLa cells), no repair defect was observed after inhibition of resection in G1 phase. These observations revealed that ESCs perform more resection than NSCs, suggesting that resection dependent-NHEJ is a prominent DSB repair pathways in G1-phase ESCs. All together, the data implies that, ESCs can perform long-range resection of DSB ends and, therefore, in case of impaired classical repair pathways, can readily switch to PARP1-dependent alt-NHEJ. Previously, it was shown that nascent RNAs mediate an error-free c-NHEJ by serving as templates to faithfully restore the lost genomic information at the break site. Moreover, it was demonstrated that RNA transcription machinery functions as a molecular motor to promote excessive DNA resection. These evidences led to the curiosity to understand if RNA mediates the long range resection in G1-phase ESCs. The detection of RNA-DNA hybrids at the DSB sites, as well as, reduction in pRPA foci level after inhibition of transcription verified our hypothesis that RNA transcription machinery might mediate long-range resection in G1 phase ESCs. Furthermore, destabilization of the RNA-DNA hybrids by overexpression of RNaseH1 enzyme, induced a significant repair defect in G1 phase ESCs. This effect was identical to the repair defect which was observed after inhibition of PLK3. These observations confirmed the role of RNA in mediating resection in G1-phase ESCs. These findings suggest that, the involvement of RNA as a template during DSB repair might be mediating an error-free repair and thus play an important role in maintaining the genomic integrity of pluripotent stem cells.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Ionisierende Strahlung (IR) verursacht verschiedene Formen der DNA-Schädigung, unter denen der DNA-Doppelstrangbrüch (DSB) der biologisch schwerwiegendste ist. In somatischen Zellen gibt es eine Vielzahl an zellulären Schadensantworten (DNA damage response, DDR), wie die Zellzykluskontrolle oder DSB-Reparaturmechanismen. Eine koordinierte Zusammenarbeit dieser Prozesse sorgt so für den Schutz vor langfristigen DNA-Schäden. Der G1/S- und G2/M-Checkpoint verhindert die Progression der Zellen in die nächste Zellzyklusphase. Durch diesen Mechanismus wird die Replikation und Teilung der Zellen verhindert, wodurch Zellen, die DSBs enthalten, genügend Zeit für die Reparatur erhalten. Die Mehrheit der IR-induzierten DSBs wird schnell über die kanonische nicht-homologe Endverknüpfung (c-NHEJ) repariert, in der DNA-PKcs eines der Kernenzyme darstellt. Im Gegensatz dazu, wird eine Subfraktion von Schäden mit langsamer Kinetik in einer ATM-abhängigen Weise repariert. Dieser Reparaturweg repräsentiert die homologe Rekombination (HR) in der G2-Phase und das resektionsabhängige c-NHEJ in der G1-Phase. In Stammzellen, bei welchen sich die DDR-Regulation von denen in somatischen Zellen unterscheidet, sind die Schlüsselfaktoren und ihre Funktionsmechanismen noch unbekannt. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus zu verstehen, durch den Stammzellen ihre genomische Integrität bewahren. Darüber hinaus wurde der Umfang der Reparaturkapazität und die Genauigkeit in pluripotenten und multipotenten Stammzellen verglichen. Um diese Ziele zu erreichen, wurde der DDR-Mechanismus in embryonalen Mausstammzellen (ESCs) und ESC-abgeleiteten neuronalen Stammzellen (NSCs) charakterisiert. Die Zellzykluskontrollanalyse nach 2 Gy-Röntgenstrahlung zeigte einen ineffektiven G1/S-Zellzyklusarrest in NSCs, während ESCs die Zellzyklusprogression in die S-Phase nicht verhindern konnten. In beiden Zelltypen wurde der Zellzyklus vollständig durch den G2/M-Checkpoint angehalten. ESCs zeigten jedoch einen längeren Zellzyklusarrest im Vergleich zu NSCs. Die Anzahl der DBS, die durch 10 mGy und 100 mGy Röntgenstrahlung in NSCs induziert wurden, ergab, dass die Reparaturkapazität durch Verringerung der Strahlendosis reduziert wurde. Nach 10 mGy IR blieb das Niveau der DSBs konstant, bis 4 h nach der Bestrahlung. Dies könnte auf eine mangelnde Aktivierung der DNA-Reparatur zurückzuführen sein. Außerdem haben wir gezeigt, dass unter diesen Bedingungen DNA-PK nicht ausreichend aktiviert wird, um H2AX in Abwesenheit von ATM zu phosphorylieren. Die Untersuchung der DSB-Reparaturkapazität nach 2 Gy-Röntgenstrahlung ergab, dass Wildtyp (WT) ESCs und NSCs ähnliche Reparaturkinetiken aufweisen und die IR-induzierten DSBs innerhalb von 6 h nach IR fast komplett repariert werden. Die ATM-Inhibition in ESCs und NSCs hatte keinen Einfluss auf die schnelle DSB-Reparaturkomponente, während die langsame Komponente beeinträchtigt war. Interessanterweise induziert die DNA-PKcs-Inhibition einen temporären Reparaturdefekt in ESCs, gefolgt von einer effizienten Reparatur auf Kontroll-Niveau. Im Gegensatz dazu, wurde die DSB-Reparatur in NSCs nach der DNA-PKcs-Inhibition fast komplett gestoppt. Die Inhibierung von Rad51 verhindert die DSB-Reparatur in G2-Phasen-NSCs, während die Reparaturkapazität in ESCs nicht betroffen war. Daraus ergab sich die Frage, ob die DSBs in DNA-PKcs- und Rad51-defizienten ESCs über einen alternativen Reparaturweg repariert werden. Um die oben genannte Frage zu beantworten, untersuchten wir die Rolle des alt-NHEJ- Reparaturweges in ESCs und NSCs durch die Inhibition von PARP1. Die PARP1-Inhibition hat dabei weder die DSB-Reparaturkinetik in WT- oder ATM-inhibierten ESCs, noch in NSCs beeinflusst. Allerdings induzierte es einen zusätzlichen, signifikanten Reparaturdefekt in DNA-PKcs- und Rad51-inhibierten ESCs, nicht jedoch in NSCs. Diese Daten zeigten, dass das PARP1-abhängige alt-NHEJ als Backup-Reparaturweg für c-NHEJ und HR in ESCs fungiert. Es ist bereits bekannt, dass PARP1-abhängiges alt-NHEJ ein resektionsabhängiger Reparaturweg ist. Untersuchungen der Resektion in der G2-Phase zeigten ein höheres Level an Rad51-Foci in ESCs, als in NSCs. Zusätzlich konnte eine Untersuchung der Resektion in der G1-Phase die Bildung von pRPA-Foci in ESCs, nicht jedoch in NSCs, bestätigt werden. Darüber hinaus verringerte die Inhibierung der Proteine, die die Resektion in der G1-Phase regulieren, wie PLK3, nicht nur die Bildung von pRPA-Foci, sondern auch die DSB-Reparatur in ESCs. Während in nicht pluripotenten Zellen (NSCs oder HeLa-Zellen) kein Reparaturdefekt nach Inhibierung der Resektion in der G1-Phase beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigten, dass ESCs mehr Resektion als NSCs durchführen. Resektionsabhängiges NHEJ stellt demnach einen prominenten DSB-Reparaturweg in G1-Phase-ESCs dar. Die gesammelten Daten implizieren, dass ESCs eine weitreichende Resektion von DSB-Enden durchführen können und daher im Falle von beeinträchtigten klassischen Reparaturpfaden leicht zu PARP1-abhängigem alt-NHEJ wechseln können. In einer Studie konnte die Beteiligung von naszierenden RNAs an einer fehlerfreien c-NHEJgezeigt werden, indem sie als Vorlagen für die genomische Information an den Bruchstellen dient. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die RNA-Transkriptions-Maschinerie als molekularer Motor fungiert, um eine exzessive DNA-Resektion zu fördern. Diese Beweise führten zu der Frage, ob RNA die Resektion in G1-Phase-ESCs vermittelt. Der Nachweis von RNA-DNA-Hybriden an den DSB-Stellen, sowie die Reduktion der pRPA-Foci nach Hemmung der Transkription, bestätigten unsere Hypothese, dass die RNA-Transkription eine weitreichende Resektion in G1-Phase-ESCs vermitteln könnte. Darüber hinaus induzierte die Destabilisierung der RNA-DNA-Hybride durch Überexpression des RNaseH1 Enzyms einen signifikanten Reparaturdefekt in G1-Phase-ESCs. Dieser Effekt war identisch mit dem Reparaturdefekt, der nach der Hemmung von PLK3 beobachtet wurde. Diese Beobachtungen bestätigten die Rolle der RNA bei der Vermittlung der Resektion in G1-Phase-ESCs. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Beteiligung von RNA als Vorlage während der DSB-Reparatur eine fehlerfreie Reparatur vermittelt und somit eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der genomischen Integrität von pluripotenten Stammzellen spielen könnte.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 15 Dec 2017 09:12
Last Modified: 15 Dec 2017 09:12
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-69751
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus and Nuber, Prof. Dr. Ulrike and Laube, Prof. Dr. Bodo and Rödel, Prof. Dr. Franz
Refereed: 14 November 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6975
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