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Regulation von zellulären Proteinnetzwerken nach Stresssignalen

Lengert, Roman Nicor :
Regulation von zellulären Proteinnetzwerken nach Stresssignalen.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Regulation von zellulären Proteinnetzwerken nach Stresssignalen
Language: German
Abstract:

Die Aufrechterhaltung des Stoffwechsels und der Funktion von lebenden Zellen erfordert das Zusammenspiel komplexer Proteinnetzwerke. Diese ermöglichen der Zelle, variierende Bedingungen und äußere Einflüsse wie ionisierende Strahlung, Chemikalien oder extreme Muskelbelastung bis zu einem gewissen Grad zu tolerieren. Die Untersuchung von Proteinnetzwerken in Ausnahmesituationen ist dabei besonders aufschlussreich, da viele Mechanismen erst durch diese aktiviert werden. Daher hatte die vorliegende Arbeit zum Ziel, die systematischen Zusammenhänge in Proteinnetzwerken nach strahleninduzierten DNA-Schäden, während der DNA-Replikation sowie während Muskelbelastung zu analysieren. Zellulärer Stress durch strahleninduzierte DNA-Schäden wurde in mehreren Teilprojekten untersucht, die sich mit der Reparaturantwort in unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus befassen. Für die Analyse von DNA-Schäden nach Bestrahlung mit niedrigen Dosen konnte im Zuge dieser Arbeit ein Verfahren entwickelt werden, das Objekte in Zellbildern automatisch bewertet und eine Klassifizierung in Reparatur-Foci und in Hintergrundobjekte ermöglicht. Es wurde speziell für den Einsatz im Niedrigdosisbereich optimiert und ist somit in der Lage, tausende Zellen in kurzer Zeit zu analysieren. Der entwickelte Fokus-Evaluationsparameter korreliert sehr gut mit einer manuellen Objektbewertung und ermöglicht dadurch die Objektklassifizierung in Niedrigdosis-Experimenten, in denen das Verhältnis von Foci zu Hintergrundobjekten sehr klein ist. Mit Hilfe des entwickelten Verfahrens konnten wichtige Hinweise auf die Aktivierungsmechanismen der zugrundeliegenden Signalnetzwerke gewonnen werden. Die Auszählung von 24 Stunden nach Bestrahlung persistierenden Foci ergab, dass die Reparaturantwort bei niedrigen Dosen weniger effizient ist als bei hohen Dosen, was auf eine nichtlineare Dynamik der Aktivierungsmechanismen hindeutet. Durch Analyse der DNA-Reparatur nach Bestrahlung und vorheriger Behandlung mit H2O2 oder NAC (N-Acetylcystein) konnte darüber hinaus die Vermutung bestätigt werden, dass reaktive Sauerstoff\-spezies eine entscheidende Rolle in der Weiterleitung des strahleninduzierten Stresssignals spielen. Neben der Aktivierung der Reparaturmechanismen wurde auch ein spezieller Mechanismus betrachtet, der essentiell für die Auflösung von Rad51-Foci nach homologer Rekombination ist. Die Modellierung von FRAP-Experimenten (Fluorescence Recovery after Photobleaching) am Protein Rad54 konnte zeigen, dass die Phosphorylierung von Rad54 eine effizientere Entfernung des Rad51-Filaments von der DNA-Schadensstelle bewirkt. Molekulardynamik-Simulationen konnten darüber hinaus Hinweise darauf geben, welche Auswirkungen die Phosphorylierung auf molekularer Ebene auf das Rad54-Protein hat. Die Simulationen deuten darauf hin, dass die Phosphorylierung das Rad54-Protein leicht stabilisiert und insbesondere im Rad54-Hexamer die Aufgabe hat, ein Gleichgewicht zwischen DNA-Bindung und Mobilität herzustellen. Die Rad54-Phosphorylierung könnte dadurch auch auf Zellebene eine entscheidende Rolle spielen, indem sie reguliert, wann die Reparatur durch homologe Rekombination während des Zellzyklus möglich ist. Neben der DNA-Reparatur ist ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit die Untersuchung der DNA-Replikation, während der die Zelle besonders sensibel gegenüber exogenen Stressfaktoren ist. Aufgrund der Komplexität des Replikationsprozesses und der enormen Menge an Basen, die repliziert werden müssen, kann es aber auch allein durch endogene Einflüsse wie aktive Transkriptionsprozesse, oxidativen Stress oder Chromatin-Verdichtungen zu Problemen im Replikationsprozess kommen, die wiederum zu DNA-Schäden führen können. Um die experimentellen Beobachtungen während der S-Phase in Bezug auf die drei grundlegenden Chromatintypen (Euchromatin, fakultatives Heterochromatin und konstitutives Heterochromatin) zu erklären, wurde ein bereits bestehendes Replikationsmodell erweitert. Dieses mit einem minimalen Satz von Parametern auskommende Modell ist in der Lage, zu erklären, wie die charakteristische Verteilung von aktivierten Origins aus wenigen zugrundeliegenden Mechanismen entsteht, wie etwa der induzierten Aktivierung von Replikations-Origins. Die Projektion auf ein dreidimensionales Random-Loop-Modell konnte darüber hinaus auch die Bildung von dreidimensionalen Clustern von Replikationsgabeln reproduzieren. Der Frage, ob während der S-Phase entstandene DNA-Schäden unabhängig voneinander repariert werden oder in einem synchronen Prozess nach Abschluss der DNA-Replikation, wurde in einem weiteren Projekt nachgegangen. Mit Hilfe verschiedener Modellvariationen zur Beschreibung der DNA-Reparatur während der S-Phase konnte gezeigt werden, dass ein Modell mit synchroner Reparatur nach Ablauf der S-Phase die experimentell ermittelte Foci-Reparaturkinetik deutlich besser beschreiben kann als ein Modell mit asynchroner Reparatur individueller Foci.

Als dritte zelluläre Situation, die Stress verursachen kann, wurde in dieser Arbeit die Belastung von Muskelzellen während und nach sportlicher Anstrengung untersucht. Analog zu den Signalnetzwerken der DNA-Reparatur müssen auch die Proteinnetzwerke, die an der Energiebereitstellung während der Muskelbelastung beteiligt sind, über effiziente nichtlineare Aktivierungsmechanismen verfügen, um in Sekundenbruchteilen genug Energie für schnelle Bewegungen bereitstellen zu können.

Es wurde ein Modell zur Simulation aller wichtigen Metaboliten während der Muskelbelastung entwickelt, das neben einer detaillierten Beschreibung der Übersäuerung auch die Degradation von Purinnukleotiden während Belastung und die De-novo-Synthese während des Erholungsintervalls mit einbezieht. Dies ermöglicht es, Vorhersagen über die Erholungsdauer nach Belastung zu machen und zu testen, welchen Einfluss eine reduzierte mitochondriale Leistungsfähigkeit, wie sie z.B. bei ME/CFS-Patienten (Myalgische Enzephalomyelitis/Chronisches Erschöpfungssyndrom) gemessen wurde, auf diese hat. Das Modell kann somit erklären, wie die verminderte mitochondriale Leistungskapazität über die zugrundeliegenden Protein-Interaktionen zu Erholungsdauern von mehreren Tagen nach moderater Anstrengung führen kann. Darüber hinaus zeigt es, dass in diesem Fall die ATP-Konzentration (Adenosintriphosphat) während der Belastung auf kritische Werte sinken kann, wohingegen die Muskelübersäuerung deutlich zunimmt.

Die im Zuge dieser Arbeit entwickelten Modelle und Auswertungsmethoden konnten somit wichtige Hinweise dazu liefern, wie Proteinnetzwerke als Reaktion auf unterschiedliche Stresssituationen zu einer Stabilisierung der Zellfunktion und zum Erhalt der Erbinformation beitragen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Maintaining the functioning of living cells requires the interplay of complex protein networks. These allow the cell to tolerate varying conditions and external influences to a certain extend, such as ionizing radiation, chemicals or extreme muscle strain. Investigations of protein networks in response to stress signals are particularly revealing since many mechanisms are only activated by just these signals. Therefore the aim of the present work was to analyze the systematic interactions in protein networks after radiation-induced DNA damage, during DNA replication, as well as during muscle exercise. Cellular stress after radiation-induced DNA damage has been studied in several projects investigating the repair response in different phases of the cell cycle. To analyze the cellular response to DNA damage after irradiation with low x-ray doses, a semi-automated method was developed in the course of this work, which automatically evaluates objects in cell images and allows classification in repair foci and in background objects. This method has been optimized for use in the low dose range and is therefore able to analyze thousands of cells in a short time. The developed focus evaluation parameter correlates well with a manual object evaluation, thereby enabling object classification in low-dose experiments where the ratio of foci to background objects can be very small. Using the semi-automated method presented here, important information about the activation mechanisms of the underlying signal networks could be obtained. The evaluation of residual foci 24 hours after irradiation revealed that the repair response is less efficient after irradiation with low doses compared to high doses indicating nonlinear dynamics of the activation mechanisms. By analyzing the DNA repair after irradiation and prior treatment with H2O2 or NAC (N-acetylcysteine), the assumption was confirmed that reactive oxygen species are crucial for the amplification of the radiation-induced stress signal. Beside the activation of the repair pathways, a mechanism was examined which is essential for the resolution of Rad51 foci after homologous recombination. The modeling of FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) experiments for the Rad54 protein showed that the phosphorylation of Rad54 plays an important role for dissociation of Rad51 from the DNA damage site. Molecular dynamics simulations provided further insights into the effects of phosphorylation at the molecular level on the structure and dynamics of the Rad54 protein. The simulations indicate that the phosphorylation stabilizes the Rad54 protein, but only slightly. Furthermore, in simulations of the Rad54 hexamer the phosphorylation is crucial to establish a balance between DNA binding and mobility. Rad54 phosphorylation could also play an important role on a cellular level by regulating when repair by homologous recombination is possible during the cell cycle. In addition to DNA repair, a second focus of this work is the investigation of DNA replication, during which the cell is particularly sensitive to exogenous stress factors. Due to the complexity of the replication process and the enormous amount of base pairs that need to be replicated, also endogenous influences such as active transcription processes, oxidative stress or chromatin compaction can lead to problems in the replication process which potentially lead to DNA damage. In order to explain the experimental observations during S-phase with respect to the three basic chromatin types (euchromatin, facultative heterochromatin and constitutive heterochromatin), an already existing replication model was extended. With a minimal set of parameter this model is able to explain how the characteristic distribution of activated origins originates from the underlying mechanisms, such as the induced activation of replication origins. Furthermore, the formation of three-dimensional clusters of replication forks can also be reproduced by projection of the one dimensional replication model onto a three-dimensional chromatin structure following a random loop model. The question of whether DNA damages occurring during S-phase are repaired independently or in a synchronous process after completion of the DNA replication, was investigated in another project. Using various model variations to describe the DNA repair during the S-phase, it was shown that the experimentally observed foci repair kinetics can be better reproduced by a model with synchronous repair after the end of S-phase compared to a model with instantaneous and asynchronous repair of individual DNA damages. As a third situation causing cellular stress the strain on muscle cells during and after exercise was considered in this thesis. Similar to the signaling networks activated after DNA damage, the protein networks that are involved in the energy supply during muscle exercise must also have efficient nonlinear activation mechanisms in order to be able to provide sufficient energy for fast movements. To investigate the cellular processes during muscle exercise, a model for the simulation of important metabolites has been developed. It includes a detailed description of acidification as well as the degradation of purine nucleotides during exercise and the de novo synthesis during the recovery interval. The model makes it possible to predict the recovery period after exercise and to test the effect of a reduced mitochondrial capacity, which is observed in some diseases such as ME/CFS (myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome). The model can thus explain how the underlying protein interactions can cause recovery times of several days after only moderate exercise for simulations with a diminished mitochondrial capacity. In addition, it shows that the ATP concentration (adenosine triphosphate) during exercise can drop to critical levels, while the muscle acidity increases significantly. Therefore, the models and evaluation methods developed in the course of this thesis provide decisive insights as to how protein networks contribute to a stabilization of the cell function and to the preservation of the genetic information in response to a wide range of stress situations.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
Divisions: 05 Department of Physics
05 Department of Physics > Institute for condensed matter physics
05 Department of Physics > Institute for condensed matter physics > Bio Physics
05 Department of Physics > Institute for condensed matter physics > Statistische Physik und komplexe Systeme
Date Deposited: 28 Nov 2017 09:52
Last Modified: 28 Nov 2017 09:52
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-69660
Referees: Drossel, Prof. Dr. Barbara and Löbrich, Prof. Dr. Marks
Refereed: 8 November 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6966
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