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Lung epithelial specific depletion of Numb and Numblike impairs epithelial polarity and integrity

Hofmann, Michael :
Lung epithelial specific depletion of Numb and Numblike impairs epithelial polarity and integrity.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Lung epithelial specific depletion of Numb and Numblike impairs epithelial polarity and integrity
Language: English
Abstract:

Previously it was shown that the membrane associated adaptor protein Numb and its cytosolic mammalian homolog Numblike (Numbl) exert redundant functions during neurogenesis and heart development [1-3]. Numb is involved in multiple processes such as endosomal trafficking, proteosomal degradation as well as the inhibition of Notch signaling [4-9]. Furthermore, Numb is reported to mediate epithelial polarity as well as cell-cell adhesion [10]. In this work I want to examine if loss of Numb and Numblike has an impact on lung epithelial integrity and its regenerative capacities upon lung damage. Therefore, I have generated conditional knockout animals for Numb on a Numblike deficient background using the doxycycline inducible SPCrtTAtet- O-Cre system, which enables to analyze functions of Numb during pulmonary development and regenerative processes after damage of the distal lung epithelium. While SPCrtTApos//tetO-Crepos//Numbfl/fl//Numblike-/- mutants (dKO) are viable they exhibit a complete loss of Numb in proximal and distal lung epithelium. Concomitant lung epithelial ablation of Numb and Numblike causes only mild morphological changes of epithelial cells accompanied by a basal-to-apicolateral translocation of ECadherin as well as a mislocalization of ß-Catenin. In addition, adult dKOs show a significant decrease in SPC+ Alveolar Type II cell numbers compared to littermate control animals (Ctrl). These changes suggest a potential function of Numb/Numblike in mediating lung epithelial polarity and integrity. Interestingly, in experimental pulmonary fibrosis Numb/Numblike deficient mice show better survival and a significant milder fibrotic damage on molecular and histological levels. I revealed impaired WNT signaling as a potential secondary effect of Numb/Numblike depletion, which might ameliorate disease progression. To further investigate the underlying molecular processes, I took advantage of shNumb/shNumblike MLE12 knockdown cells, which show mislocalization of E-Cadherin, decreased ß-Catenin levels and reduced Wnt target gene expression similar to the in vivo state. In vitro rescue of ß- Catenin protein levels and relative expression of Wnt targets by GSK-3ß inhibition support an involvement of WNT/ß-Catenin signaling. Moreover, I identified Cortactin and CK2 as a novel interaction partners of Numb and Numblike mediating cell junctional stability in epithelial cells.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Numb ist ein membrangebundenes Adapterprotein, welches Ähnlichkeiten zu seinem cytoplasmatischen Homolog Numblike aufweist. Beide Gene spielen beispielsweise eine große Rolle in Gehirn- oder auch Herzentwicklung. Auf molekularer Ebene ist Numb in verschiedenste Prozessen involviert, wie z.B. bei Endocytose, Proteasom regulierter Proteindegradierung oder auch der Inhibition des Notch Signalwegs. Des weiteren spielt Numb auch eine wichtige Rolle bei der Etablierung von Zell-Zell Kontakten, sowie epithelialer Polarität. In dieser Studie sollte untersucht werden, ob ein Fehlen von Numb und Numlike im Lungenepithel dessen Integrität oder auch dessen Regenerationsfähigkeit beeinflusst. Hierzu wurde Numb konditionell und lungenepithelspezifisch in Mäusen mit Numblike ablatiertem Hintergrund genetisch inaktiviert. Dabei wurde ein durch Doxycyclin induzierbares Inaktivierungssystem (SPCrtTA-tet-O-Cre) benutzt, welches die funktionelle Charakterisierung von Numb und Numblike im Lungenepithel ermöglicht. Tiere, die einen Verlust der Genaktivität von Numb und Numblike im Epithel zeigen, sind lebensfähig und offenbaren lediglich schwache morphologische Veränderungen epithelialer Zellen. Diese Zellen weisen eine veränderte Lokalisation der Adhärenzkontaktproteine E-Cadherin und ß- Catenin in der Zellmembran auf. Zudem ist in den Doppelmutanten eine deutliche Reduktion von Alveolaren Zellen des Typs II zu verzeichnen. Diese Veränderungen deuten auf eine wichtige Funktionen von Numb und Numblike in der Erhaltung von epithelialer Integrität sowie Polarität hin. Erstaunlicherweise zeigen doppelmutante Tiere eine merklich schwächer ausgeprägte Fibrose nach Behandlung mit Bleomycin. Die Tiere weisen eine höhere Überlebensrate auf und zeigen auch sonst verbesserte Werte auf molekularer und histologischer Ebene. Besonders auffällig hierbei sind Veränderungen des Wnt/ß-Catenin Signalwegs als möglicher Effekt der Numb/ Numblike Inaktivierung. Der Fibroseverlauf könnte hierdurch maßgeblich beeinflusst und abschwächt sein. Durch die Inaktivierung von Numb und Numblike in der lungenepithelailen Zelllinie MLE12 erlangte ich einen tieferen Einblick in veränderte molekulare Prozesse und konnte ebenso bereits in vivo ermittelte Ergebisse, wie ECadherin/ ß-Catenin Lokalisierung sowie beeinträchtigte Expression von Wnt- Zielgenen reproduzieren und validieren. Expression von ß-Catenin, ebenso wie die seiner Zielgene, konnte hier mittels GSK-3ß Inhibition verbessert werden, was weiterhin eine Beeinträchtigung von Wnt/ß-Catenin Signalen in Numb/Numblike defizienten Epithelzellen unterstreicht. Schließlich konnten mit Hilfe von massenspektrometrischer Analyse die Kinase CK2 sowie Cortactin, ein F-Aktin bindendes Protein, als neue Interaktionspartner von Numb und Numblike identifiziert werden. Diese könnten das Mitwirken von Numb in der Ausbildung von Zell-Zell Kontakten, sowie deren Stabilisierung, unterstützt durch cytoplasmatisches Numblike, erklären.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Stem Cell and Developmental Biology
10 Department of Biology > Developmental Biology and Neurogenetics
Date Deposited: 12 Dec 2017 11:00
Last Modified: 12 Dec 2017 11:00
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-69161
Referees: Galuske, Prof. Dr. Ralf and Layer, Prof. Dr. Paul G. and Braun, Prof. Dr. Thomas
Refereed: 12 July 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6916
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