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Structure-Based Monomerization of Human Serine Protease HTRA1 towards Evolutive Engineering of Activity Modulators

Weber, Niklas :
Structure-Based Monomerization of Human Serine Protease HTRA1 towards Evolutive Engineering of Activity Modulators.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Structure-Based Monomerization of Human Serine Protease HTRA1 towards Evolutive Engineering of Activity Modulators
Language: English
Abstract:

Human serine protease HTRA1 plays an important role in a plethora of physiological processes by recognition and conversion of numerous different substrates. Various studies suggested that HTRA1 is involved in several diseases, such as osteoarthritis, cancer, age-related macular degeneration or Alzheimer disease. The aim of this work was the generation of molecules that modulate HTRA1 activity, which could act as tools for validation of HTRA1 as a potential therapeutic target. An initial approach was the monomerization of multimeric HTRA1 that is composed of trimers as well as higher oligomers of unknown composition to get an easier to handle and more controllable target for evolutionary design of interacting molecules. Accordingly, structural data of the trimer was applied for the design of amino acid replacements that are supposedly important for trimerization, resulting in stable monomeric fractions of HTRA1 catalytic domain. Three different scaffold libraries were screened by yeast surface display towards binding of monomeric HTRA1. The miniprotein McoTI II-based library, which is a trypsin inhibitor from squash plant, delivered a single molecule that bound monomeric HTRA1 with nanomolar affinity, but not native trimeric HTRA1. Similarly, the two molecules isolated from an immunized VHH library, which is the variable domain of a single domain camelid immunoglobulin, also bind only monomeric HTRA1 with nanomolar affinities, but not native trimeric HTRA1. The third library was a vNAR library, which is the variable domain of a single domain shark immunoglobulin that was synthetically randomized in CDR3. Six independent molecules were isolated against monomeric HTRA1 and five of them were shown to bind native trimeric HTRA1 with micromolar affinities. By stepwise affinity maturation of CDR1 and HV2, affinities were improved to double digit nanomolar affinities. Finally, promising vNAR molecules were soluble expressed and evaluated for modulation of HTRA1 activity by activity assays, resulting in three molecules that enhance HTRA1 activity in a range from 150 % to 400 %. Therefore, we successfully generated activators that enhance HTRA1 activity with different strengths that can be used in in vitro and in vivo assays for validation of human HTRA1 as novel therapeutic target.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die humane Serinprotease HTRA1 spielt eine wichtige Rolle bei vielen verschiedenen physiologischen Prozessen. Sie ist dabei an der Erkennung und Prozessierung einer Vielzahl verschiedener Substrate beteiligt. Eine wachsende Zahl an Studien deutet darauf hin, dass HTRA1 bei der Entstehung oder Progression unterschiedlicher Krankheiten wie beispielsweise Arthrose, Krebs, altersbedingter Makulardegeneration oder Alzheimer eine Rolle spielt. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Modulatoren, welche die Aktivität von HTRA1 beeinflussen, um dadurch Werkzeuge zur Validierung von HTRA1 als mögliches Zielmolekül für neue Therapieansätze zu generieren. Der ursprüngliche Ansatz war die Herstellung von Monomeren der multimeren Protease HTRA1, welche sich sowohl als Trimer, oder als höheres Oligomer von unbekannter Zusammensetzung, assembliert. Der erste Schritt zur Monomerisierung des Zielmoleküls sollte zu einem leicht handhabbaren und beherrschbaren Zielmolekül für das evolutive Proteindesign führen. Daher wurden Strukturdaten des Trimers genutzt um Aminosäureaustausche vorzunehmen, die als hauptursächlich für die Trimerisierung beschrieben wurden. Diese führten zu stabilen, monomeren Fraktionen der katalytischen Domäne von HTRA1. Proteinbibliotheken drei verschiedener Grundgerüste wurden für die Durchmusterung nach Bindern für monomeres HTRA1 eingesetzt. Die auf dem Miniprotein McoTI-II basierende Bibliothek, welches ein Trypsin Inhibitor aus Kürbisgewächsen ist, lieferte ein einzelnes Molekül, welches zwar mit nanomolarer Affinität monomeres HTRA1, aber nicht natives trimeres, erkannte. Ähnlich verhielten sich die beiden Moleküle, die aus einer immunisierten cameliden VHH Bibliothek, wobei es sich um die variable Domäne eines Einzelketten-Immunglobulins eines Lamas handelt, isoliert wurden. Hier erkannten ebenfalls beide Moleküle zwar das monomere HTRA1 mit nanomolaren Affinitäten, aber nicht das native, trimere. Bei der dritten Bibliothek handelte es sich um ein vNAR Grundgerüst, welches die variable Domäne eines Einzelketten-Immunglobulins von Haien darstellt, bei der CDR3 synthetisch randomisiert wurde. Bei der Durchmusterung wurden sechs Moleküle isoliert, die mikromolare Affinitäten gegenüber monomerem HTRA1 aufwiesen und von denen fünf auch natives, trimeres HTRA1 erkannten. Durch schrittweise Affinitätsmaturierung von CDR1 und HV2 konnten Affinitäten im zweistellig nanomolaren Bereich erzielt werden. Zuletzt wurden die erfolgversprechenden vNAR Varianten löslich exprimiert und in Aktivitätstests wurde überprüft, ob sie einen Einfluss auf die Aktivität von HTRA1 haben. Drei Moleküle erhöhten die Aktivität in einem Bereich von 150 % bis 400 %. Diese Modulatoren können für in vitro und in vivo Analysen eingesetzt werden und dazu beitragen die Frage zu beantworten, ob HTRA1 ein sinnvolles therapeutisches Ziel darstellt.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 30 Nov 2017 14:14
Last Modified: 30 Nov 2017 14:14
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-69080
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Warzecha, Prof. Dr. Heribert
Refereed: 17 October 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6908
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