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Selectivity in histone deacetylase inhibition: A biophysical approach

Meyners, Christian Stephan :
Selectivity in histone deacetylase inhibition: A biophysical approach.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Selectivity in histone deacetylase inhibition: A biophysical approach
Language: English
Abstract:

The development of selective and save compounds is an important task in drug discovery and during the past 25 years biophysical methods for the characterization of protein-ligand interactions have been developed to a valuable tool. On the one hand these methods allow to validate screening hits and on the other hand they complement traditional approaches in drug discovery by providing deep insights into the thermodynamics, kinetics and the mechanism of molecular interactions. Based on these information, approaches were developed which allow to identify promising lead structures for further development. Histone deacetylases (HDACs) are a protein family which are investigated as therapeutic targets for the treatment of different diseases like cancer neurodegenerative disorders and parasitic infections. By catalyzing the deacetylation of the ε-amino function of lysines of histones and other proteins they fulfill an important function for the epigenetic regulation. With SAHA, FK228, PXD101 and LBH589 four HDAC inhibitors were approved for the treatment of different cancers. They cause several unwanted side effects. SAHA, PXD101 and LBH589 are unselective inhibitors which inhibit most HDAC isotypes. In order to minimize unwanted side effects and to provide a more specific therapy isotype selective inhibitors are developed. The present work deals with the question how information from an analysis of the thermodynamics, kinetics and binding mechanisms can be exploited to characterize the selectivity of inhibitors of the HDAC family. The generated results of this doctoral thesis are provided in the cumulative part which consists of five articles published in peer reviewed journals and one article submitted for peer review. One the one hand they extend the methodology on the identification and biophysical characterization of HDAC inhibitors and on the other hand they contribute to the deep comprehension of the molecular basis of the inhibition of HDACs and of protein-ligand interactions.

The first part of this work covers methods developed for the identification and biophysical characterization of HDAC inhibitors. In a cooperation with the research group of Prof. Wessig at the University of Potsdam ligands were generated whose fluorescence lifetime change upon binding to histone deacetylases. By a displacement of the ligands from the active site the binding of HDAC inhibitors can be monitored. A developed competitive binding assay is outstandingly suited for high throughput screening applications and the determination of binding constants. Furthermore, the developed assay is also applicable for class IIa HDACs resulting in the first binding assay for this HDAC class. For the determination of kinetic parameters and the binding mechanism of the binding inhibitors to histone deacetylases an established fluorescence spectroscopic binding assay was modified, so that a time-resolved monitoring of the binding of nonfluorescent ligands is allowed. The determined kinetic traces were subjected to a global fit analysis. With this method the reaction mechanisms of the binding of four ligands to the human histone deacetylases 1, 6 and 8 as well as to a bacterial histone deacetylase-like amidohydrolase were evaluated.

In the second part of this work it was evaluated on the basis of a histone deacetylase-like amidohydrolase from Pseudomonas aeruginosa, HDAHpa, which structural elements of HDAC inhibitors affect the selectivity and how mechanistic and thermodynamic parameters can be applied to assess the selectivity. Therefore, the reaction mechanisms and the thermodynamic signature of structurally related inhibitors of the known HDAC inhibitor N-hydroxy-N′-phenyloctanediamide (SAHA) were determined and evaluated for their selectivity against the human histone deacetylases 1–8. Generally, SAHA and other compounds with a hydroxamic acid as zinc binding moiety exhibit a good selectivity against class IIa HDACs. In contrast, the compound SATFMK, where the hydroxamic acid moiety is exchanged by a trifluoromethyl ketone moiety, exhibits a good to very good selectivity against the HDACs 1–3 and 6 but a lower selectivity against class IIa HDACs and HDAC8. With an at least 1000-fold selectivity over human HDACs the highest selectivity was determined for the compound PFSAHA. This compound exhibits, compared to SAHA and SATFMK, a sterically more demanding perflourinated spacer. Furthermore, it was determined in another study that upon an exchange of the cap group the high selectivity is preserved in most cases and can be improved by methylation and chlorination. Surprisingly, an analysis of the determined binding mechanisms suggests that PFSAHA and SATFMK bind each to other protein conformations as the other ligands. These results support the assumption that selective ligands can be identified on the basis of their binding mechanism. In order to deepen the knowledge about the molecular recognition of inhibitors by HDAHpa the binding reactions were studied by isothermal titration calorimetry. The determination of the thermodynamic parameters revealed that the binding of PFSAHA to HDAHpa occurs with unfavorable entropic contributions and is solely enthallpically driven, while for the binding of SATFMK the entropic and enthalpic contributions are balanced. This indicates indeed that for selective binders the enthalpic contributions are more pronounced. However, the enthalpic contributions to binding are of limited suitability for the prediction of the selectivity of HDAC inhibitors. Only a newly defined enthalpy weighted binding constant exhibits a good correlation to the determined selectivity of the HDAC inhibitors. Certainly, the applicability and transferability to other protein targets have yet to be evaluated. In a further study, the binding of PFSAHA and SATFMK to HDAHpa and a to HDAHpa homologous histone deacetylase-like amidohydrolase from Bordetella/Alcaligenes were investigated in more detail by protein crystallography and isothermal titration calorimetry. It was shown, that the thermodynamic signature and the mechanism of the binding reaction is largely influenced by flexibility and accessibility of the active site. With a better accessibility and a higher flexibility the binding occurs in an apparent one-step reaction and with more favorable enthalpic contributions to binding. But these are balanced by enthalpy-entropy compensation resulting in an unchanged binding affinity. These findings seem to be exceptionally important for the development of HDAC inhibitors, since HDACs interact with several proteins and it is likely that these interactions alter the flexibility of the HDACs and with it the recognition of ligands. Taken together these studies indicate that generally a solely consideration of thermodynamic signatures is insufficient for the identification of selective compounds, but especially in combination with mechanistic investigations useful information about the potential selectivity of compounds are provided, which supplement existing parameters for the early identification of leads with a high probability of success.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die Entwicklung von selektiven und sicheren Wirkstoffen ist eine wichtige Aufgabe in der pharmazeutischen Forschung und in den letzten 25 Jahren sind biophysikalische Methoden zur Charakterisierung von Protein-Ligand Wechselwirkungen zu einem wichtigen Hilfsmittel entwickelt worden. Zum einem erlauben diese Methoden eine Verifizierung von in Hochdurchsatzverfahren identifizierten Molekülen und zum anderen ergänzen sie traditionelle Ansätze zum Wirkstoffdesign, durch tiefe Einblicke in die Thermodynamik, Kinetik und den Mechanismus der Interaktion. Basierend auf diesen Informationen wurden Rationalen entwickelt, die zur Identifizierung von vielversprechenden Leitstrukturen genutzt werden können. Histondeacetylasen (HDACs) sind eine Familie von Proteinen, die intensiv als therapeutische Ziele für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten, unter anderem Krebs, neurodegenerativen Krankheiten und parasitäreren Infektionen untersucht werden. Sie katalysieren die Deacetylierung der ε-Aminofunktion von Lysinen von Histonen und anderen Proteinen, wodurch sie wichtige Funktionen in der epigenetischen Regulation ausüben. Mit SAHA, FK228, PXD101 und LBH589 wurden vier Histondeacetylase-Inhibitoren zur Behandlung von verschiedenen Tumorerkrankungen zugelassen. Diese verursachen zahlreiche Nebenwirkungen. SAHA, PXD101 und LBH589 sind unspezifische Inhibitoren, die nahezu alle Isotypen der HDACs hemmen. Durch eine Entwicklung von selektiven Inhibitoren sollen Nebenwirkungen minimiert werden und gleichzeitig eine spezifischere Therapie ermöglicht werden. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, inwieweit Informationen aus der Analyse der Thermodynamik, Kinetik und Bindemechanismen genutzt werden können, um die Selektivität von Inhibitoren der HDAC-Familie zu beschreiben. Die im Rahmen dieser Doktorarbeit erzielten Ergebnisse sind im kumulativen Teil, bestehend aus fünf in begutachteten Zeitschriften publizierten Artikeln und einer zur Begutachtung eingereichten Publikation, dargestellt. Sie liefern zum einen Beiträge zur Methodik der Identifizierung und biophysikalischen Charakterisierung von Histondeacetylase-Inhibitoren, und zum anderen tragen sie zum tiefen Verständnis der molekularen Grundlagen der Inhibition von HDACs im Speziellen und von Protein-Ligand-Wechselwirkungen im Allgemeinen bei. Der erste Teil dieser Arbeit beinhaltet Methodenentwicklungen zur Identifizierung und biophysikalischen Charakterisierung von Histondeacetylase-Inhibitoren. In einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Wessig von der Universität Potsdam wurden Liganden entwickelt, deren Fluoreszenzlebensdauer sich bei der Bindung an HDACs ändert. Über eine Verdrängungsreaktion kann die Bindung von Histondeacetylase-Inhibitoren bestimmt werden. Ein daraus entwickelter kompetitiver Bindeassay ist für Anwendungen im Hochdurchsatz-Screening und zur Bestimmung von Bindekonstanten hervorragend einsetzbar. Ferner eignet sich der erstellte Assay auch für Anwendungen mit Klasse IIa HDACs, womit der erste Bindeassay für diese Klasse entwickelt werden konnte. Zur Ermittlung von kinetischen Parametern und des Mechanismus der Bindung von Inhibitoren an HDACs wurde ein bestehender fluoreszenzspektroskopischer Bindeassay modifiziert, sodass zeitaufgelöst die Bindung von nichtfluoreszenten Liganden gemessen werden kann. Die ermittelten Kinetiken wurden mit einer globalen Fitanalyse analysiert. Mit dieser Methodik wurden die Reaktionsmechanismen für die Bindung von vier verschiedenen Liganden an die humanen HDACs 1, 6 und 8 sowie an eine bakterielle Histondeacetylase-ähnliche Amidohydrolase ermittelt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde am Beispiel der Histondeacetylase-ähnlichen Amidohydrolase aus Pseudomonas aeruginosa, HDAHpa, evaluiert, welche strukturellen Eigenschaften von Histondeacetylase-Inhibitoren die Selektivität beeinflussen und inwiefern mechanistische und thermodynamische Parameter zur Bewertung der Selektivität verwendet werden können. Hierzu wurden die Reaktionsmechanismen und die thermodynamische Signatur von strukturverwandten Inhibitoren des bekannten Histondeacetylase-Inhibitor N-Hydroxy-N′-phenyloctandiamid (SAHA) bestimmt, und deren Selektivität gegen die humanen HDACs 1–8 ermittelt. Im Allgemeinen zeigen SAHA und andere Liganden mit Hydroxamsäuren als zinkbindende Gruppe eine gute Selektivität gegenüber HDACs der Klasse IIa. Demgegenüber besitzt SATFMK, bei dem die Hydroxamsäurefunktion gegen eine Trifluormethylcarbonylgruppe ausgetauscht ist, eine gute bis sehr gute Selektivität gegen die HDACs 1–3 und 6, aber eine geringere Selektivität gegenüber HDACs der Klasse IIa und HDAC8. Mit einer mindestens 1000fachen Selektivität gegenüber den humanen HDACs konnte die höchste Selektivität für HDAHpa beim Liganden PFSAHA beobachtet werden. Dieser besitzt eine im Vergleich zu SAHA und SATFMK sterisch anspruchsvollere perfluorierte Alkylkette. Ferner wurde in einer weiteren Studie festgestellt, dass die hohe Selektivität von PFSAHA bei einer Variation der Kopfgruppe in vielen Fällen erhalten bleibt und durch Methylierung oder Chlorierung noch gesteigert werden kann. Überraschenderweise, ergab eine Analyse der Bindemechanismen, dass PFSAHA und SATFMK je an andere Proteinkonformationen binden als die übrigen Liganden. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass selektive Liganden anhand ihres Bindemechanismus identifiziert werden können. Zur Vertiefung des Verständnisses der molekularen Erkennung von Inhibitoren durch HDAHpa wurden die Bindungsreaktionen mittels isothermer Titrationskalorimetrie untersucht. Die Bestimmung der thermodynamischen Parameter zeigte, dass die Bindung von PFSAHA an HDAHpa mit einer unvorteilhaften Entropieänderung ausschließlich über enthalpische Beiträge erfolgt, während bei SATFMK die enthalpischen und entropischen Beiträge ausgeglichen sind. Dies deutet in der Tat darauf hin, dass der enthalpische Beitrag bei selektiven Liganden höher ausgeprägt ist. Dennoch hat sich gezeigt, dass der enthalpische Beitrag zur Bindungsreaktion nur bedingt zur Vorhersage der Selektivität von Histondeacetylase-Inhibitoren geeignet ist. Erst eine neu definierte enthalpiegewichtete Bindekonstante zeigt eine gute Korrelation zur bestimmten Selektivität der Histondeacetylase-Inhibitoren. Allerdings müssen die Anwendbarkeit und Übertragbarkeit dieses empirischen Parameters für andere Proteintargets noch evaluiert werden. In einer weiteren Studie wurde die Bindung von PFSAHA und SATFMK an HDAHpa und eine zu HDAHpa homologe Histondeacetylase-ähnlichen Amidohydrolase aus Bordetella/Alcaligenes durch Proteinkristallographie und isothermer Titrationskalorimetrie detaillierter untersucht. Es konnte ermittelt werden, dass die Flexibilität und die Zugänglichkeit der Bindetasche einen wesentlichen Einfluss auf die Thermodynamik und den Mechanismus der Bindung hat. Bei einer besseren Zugänglichkeit und einer erhöhten Flexibilität erfolgt die Bindung in einer apparenten Einschritt-Reaktion und mit einem höheren enthalpischen Beitrag zur Bindungsreaktion. Dieser wird allerdings durch Enthalpie-Entropie-Kompensation ausgeglichen, sodass es zu keiner Veränderung der Affinität kommt. Diese Ergebnisse erscheinen außerordentlich wichtig für die Entwicklung von Histondeacetylase-Inhibitoren, da HDACs mit vielen Proteinen interagieren und es wahrscheinlich ist, dass dies die Flexibilität der HDACs und damit die Ligandenbindung beeinflusst. Zusammenfassend zeigen diese Studien, dass eine bloße Betrachtung der Thermodynamik für die Identifizierung von selektiven Liganden im Allgemeinen nicht ausreicht, aber besonders in Verbindung mit mechanistischen Untersuchungen wertvolle Informationen über die potentielle Selektivität von Wirkstoffen liefert und vorhandene Parameter zur frühen Identifikation der Wirkstoffkandidaten mit der höchsten Erfolgswahrscheinlichkeit ergänzt.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 25 Jul 2017 09:50
Last Modified: 25 Jul 2017 09:50
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-65896
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Meyer-Almes, Prof. Dr. Franz-Josef and Jaenicke, Prof. Dr. Elmar
Refereed: 3 July 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6589
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