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Immunologische und molekularbiologische Untersuchungen des outer membrane protein A von Proteus mirabilis

Hotz, Mark :
Immunologische und molekularbiologische Untersuchungen des outer membrane protein A von Proteus mirabilis.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2006)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Immunologische und molekularbiologische Untersuchungen des outer membrane protein A von Proteus mirabilis
Language: German
Abstract:

In dieser Arbeit wurde der Einfluß des outer membrane protein A (OmpA) von Proteus mirabilis auf die Aktivierung von Makrophagen mit LPS untersucht. Zudem wurde die Nukleotidsequenz des ompA-Gens aus Proteus mirabilis 19 erstmalig sequenziert und sowohl das native wie auch rekombinante OmpA-Fragmente serologisch charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß OmpA sehr schwache aktivierende Eigenschaften besitzt. In Abhängigkeit der bakteriellen Herkunft konnten Unterschiede in ihrer Wirkungsweise der verschiedenen OmpA-Proteine beobachtet werden, was möglicherweise auf physiologisch-chemische Eigenschaften zurückzuführen ist. Untersuchungen an LPS-toleranten Makrophagen aus C3H/HeJ-Mäusen haben zusätzlich gezeigt, daß OmpA Makrophagen nicht über den Toll-like-Rezeptor (TLR) 4 aktiviert. Der Verlauf der Stimulierung war mit der von LPS vergleichbar, nur viel schwächer. In diesem Zusammenhang führte die Zugabe des allgemeinen Proteinkinase-Inhibitors Staurosporin bei der OmpA-induzierten Produktion von IL-1beta stets zu einer Erhöhung der IL-1beta-Menge. Dieser Effekt war ähnlich der Wirkung von Staurosporin auf LPS-aktivierte Makrophagen. Ferner konnte OmpA in Reportergen-Transfektionsversuchen die Aktivität eines LPS-induzierbaren IL-1beta-Promotors induzieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß OmpA ein besonders effektiver Modulator der Immunantwort gegen LPS ist, wobei die Steuerung der Zytokinproduktion auf der Ebene der Promotoraktivität der Gene erfolgte. Im Rahmen dieser Arbeit konnte das 39 kDa OmpA von P. mirabilis 19 erstmals vollständig entschlüsselt werden. Bestehend aus 362 Aminosäuren (aa) ist es deutlich größer als das OmpA verwandter Bakterien, wie z.B. Escherichia coli (346 aa). Den phylogenetischen Untersuchungen auf der Basis der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zufolge, weist es im Vergleich mit dem OmpA von E. coli einen Identitätsindex von 68% und einen Ähnlichkeitsindex von 79% auf. Auf der Grundlage der gewonnen Sequenzinformationen wurden unterschiedliche OmpA-Fragmente rekombinant hergestellt und für die serologische Charakterisierung der monoklonalen Antikörper mAk 2.14.1 und mAk 2.18.1, die gegen das OmpA aus P. mirabilis 19 gerichtet sind, verwendet. Diese Untersuchungen haben gezeigt, daß mAk 2.14.1 gegen ein hoch konserviertes generisches Epitop bei allen untersuchten OmpA-Proben (P. mirabilis, E. coli, Salmonella typhimurium und Erwinia amylovora) gerichtet ist, während mAk 2.18.1 gegen ein spezifisches Epitop für P. mirabilis gerichtet ist. Weitere Untersuchungen mit den monoklonalen Antikörpern gaben erste Hinweise darauf, daß diese zwei Epitope in unterschiedlichen Bereichen des Proteins liegen. Während das spezifische Epitop im zentralen Bereich des Proteins sitzt, konnte die Position des generischen Epitops im N-terminalen Bereich des Proteins lokalisiert werden. Da die Arbeiten den Umgang mit Methoden der Biotechnologie bzw. Gentechnik beinhalten und auch mit der Problematik der möglichen Anwendung von Forschungsergebnissen für therapeutische Zwecke verbunden sind, wurde begleitend zu den naturwissenschaftlichen Arbeiten eine Technikfolgenabschätzung am Beispiel der Rheumatoiden Arthritis nach dem Modell der ethischen Urteilsbildung durchgeführt. Das vorrangige Ziel dieser vorliegenden Technikfolgenabschätzung war es, auf die Bedeutung der Reflexion molekularbiologischer Forschungen einzugehen, um positive und negative gesellschaftliche Folgen solcher Ansätze, sowie ethische Zusammenhänge sichtbarer zu machen. Wie die Ergebnisse gezeigt haben, können ethische Modelle sehr nützlich bei der Urteilsbildung und Reflexion über Forschungsstrategien sein und können zu einem erhöhten Bewußtsein gegenüber bestimmter beteiligter Risiken führen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The influence of outer membrane protein A (OmpA) from Proteus mirabilis on the activation of macrophages with LPS was investigated. In addition, the nucleotide sequence of the OmpA gene from Proteus mirabilis 19 was sequenced for the first time and both the native as well as recombinant OmpA fragments were characterized serologically. It could be shown that OmpA possesses very weak activating characteristics. Depending on the bacterial origin, differences in the activities of the various OmpA proteins could be observed, possibly due to physio-chemical characteristics. Studies on LPS-tolerant macrophages of C3H/HeJ mice demonstrated that OmpA does not activate macrophages over the Toll-like receptor (TLR) 4. The process of stimulation was comparable to that of LPS, only much weaker. In this connection, the addition of the general protein kinase inhibitor staurosporine led to increased production of IL-1beta by OmpA. This effect was similar to the effect of staurosporine on LPS-activated macrophages. Furthermore, OmpA could induce the activity of an LPS-inducible IL-1beta-promoter in reporter gene assays. In addition, it could be shown that OmpA is a particularly effective modulator of the immune response to LPS, whereby the control of cytokine production took place at the level of gene promoter activity. In the context of this work, the 39 kDa OmpA of P. mirabilis 19 was sequenced completely. The protein consists of 362 amino acids (aa) and is therefore larger than the OmpA of related bacteria, e.g. Escherichia coli (346 aa). According to phylogenetic investigations based on the derived amino acid sequences, OmpA from P. mirabilis exhibits an identity index of 68% and a similarity index of 79% in comparison with OmpA of E. coli. On the basis of the sequence information gained, different fragments of the OmpA gene from P. mirabilis 19 were cloned and the protein fragments expressed in E. coli. These were used for the further serological characterisation of two monoclonal antibodies (mAk 2.14.1 and mAk 2.18.1) directed against the OmpA protein from P. mirabilis 19. These investigations showed that mAk 2.14.1 is directed against a highly conserved generic epitope on all examined OmpA samples (P. mirabilis, E. coli, Salmonella typhimurium and Erwinia amylovora), while mAk 2.18.1 is directed against an epitope specific to P. mirabilis. Further investigations with the monoclonal antibodies gave first an indication that these epitopes lie in different regions of the protein. While the specific epitope is located in the central region of the protein, the position of the generic epitope seems to be located within the N-terminal region of the protein. Since the work involves using methods of biotechnology and genetic engineering and is also connected with the problem of the possible use of research results for therapeutic purposes, a technology assessment was carried out using the example of therapy for rheumatoid arthritis and applying a model for reaching ethical judgments. The main goal of this technology assessment was to focus on the importance of reflection while carrying out molecular-biological research, in order to make positive and negative social consequences of such approaches as well as the ethical context more visible. As the results showed, ethical models can be very helpful in making judgments about research strategies and in forming a basis for consideration of the risks that may be involved.English
Uncontrolled Keywords: OmpA, Proteus, TLR, Makrophage, RAW, C3H, mAk, Arthritis, Urteilsbildung, Technikfolgenabschätzung
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
OmpA, Proteus, TLR, Makrophage, RAW, C3H, mAk, Arthritis, Urteilsbildung, TechnikfolgenabschätzungGerman
ompA, proteus, toll-like receptor, macrophageEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:51
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000641
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-6416
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Nixdorff, Prof. Dr. Kathryn and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Advisors: Nixdorff, Prof. Dr. Kathryn
Refereed: 23 September 2005
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/641
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