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The Guardians of the Epigenome - Regulation and Role of Nucleotide Modifications

Ludwig, A. K. :
The Guardians of the Epigenome - Regulation and Role of Nucleotide Modifications.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: The Guardians of the Epigenome - Regulation and Role of Nucleotide Modifications
Language: English
Abstract:

While from a genetic perspective all cells of an organism are identical, they vary greatly in type and function. Major determinants of cellular diversity are epigenetic alterations, including post-synthetic modifications of nucleic acids. In DNA, the best-studied chemical modification is the methylation of cytosine at carbon C5. 5-methylcytosine (5mC) plays a central role in the regulation of gene expression and has been implicated in a variety of biological processes and diseases. While initially considered as a relatively stable epigenetic mark, a family of proteins named Ten eleven translocation (Tet), were recently shown to catalyze the conversion of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) in an iterative oxidation reaction. These oxidized derivatives have been shown to modulate gene expression and control cellular metabolism. Hence, to avert the formation of aberrant, pathogenic DNA modifications, Tet activity must be precisely regulated. Here, we analyzed the potential of methyl-CpG binding domain (MBD) proteins to control Tet dioxygenase activity in vitro and in vivo. We demonstrate that prior binding of Mecp2 and Mbd2 to DNA protects 5mC from Tet1 mediated oxidation in a concentration dependent manner. The mechanism is based on competitive, sequence unspecific binding to DNA and correlates with nucleic acid coverage and retention time of MBD proteins on DNA. Accordingly, we find increased levels of the Tet oxidation product 5hmC at pericentric heterochromatin in neurons of Mecp2 deficient mice with concomitant reactivation of highly methylated major satellite DNA repeats. Moreover, we find increased expression and retrotransposition of endogenous and engineered long interspersed nuclear elements (LINE1) as potential consequence of unconfined Tet1 activity in human cells. Similar to DNA, RNA contains a variety of post-synthetic modifications that extend their chemical information and properties. One out of < 100 noncanonical ribonucleobases is C5-methylated cytosine, which is present in various types of RNA, including ribosomal RNA (rRNA). Recent studies have shown that Tet proteins do not exclusively hydroxylate methylcytosine in DNA, but also act on 5mC in single-stranded ribonucleic acids. Since modification of rRNA potentially requires the localization of Tet proteins to the nucleolus, the place of rRNA synthesis and ribosome assembly, it is important to understand the general principles of protein targeting to this subnuclear compartment. Therefore, we determined the molecular requirements that are necessary and sufficient for the localization and accumulation of peptides and proteins inside nucleoli of living cells. Our data indicate that peptide units composed of consecutive, positively charged arginines with an isoelectric point ≥ 12.6 meet the chemical conditions for nucleolar localization. Consistent with this, we mapped an arginine-rich region within the low complexity insert of Tet2, which accumulated in nucleoli upon deletion of its regulatory N-terminal domain. Using a pH sensitive dye, we revealed that the nucleolus is relatively acidic. Accordingly, we show that arginine-rich peptides, which carry a net positive charge under these electrochemical conditions, interact with negatively charged RNA in vitro. This interaction in turn, is consistent with the conservation of this nucleolar targeting principle from insects to man. Finally we developed a detailed protocol for the visualization of nucleoli in living cells using fluorescently tagged cell-penetrating peptides (CPP), which allows precise nucleolar localization analysis of various proteins, such as Tet. In summary, our data contribute to understanding the regulation of Tet activity outside and (Tet) protein localization inside of nucleoli.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Aus genetischer Sicht sind alle Zellen eines Organismus identisch, jedoch unterscheiden sie sich deutlich in ihrer Art und Funktionsweise. Wichtige Determinanten zellulärer Diversität sind epigenetische Änderungen, darunter post-synthetische Modifikationen von Nukleinsäuren. Die am besten untersuchte chemische Modifikation von DNA ist die Methylierung von Cytosin am fünften Kohlenstoffatom. 5-Methylcytosin (5mC) spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression und steht in Verbindung mit einer Vielzahl biologischer Prozesse und Krankheiten. Obwohl zunächst angenommen wurde, dass 5mC eine relativ stabile epigenetische Modifikation ist, wurde kürzlich gezeigt, dass eine Familie von Proteinen, Ten eleven translocation (Tet), die Umsetzung von 5mC zu 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC), 5-Formylcytosin (5fC) und 5-Carboxylcytosin (5caC) katalysiert. Es wurde gezeigt, dass diese oxidativen Derivate an der Modulierung der Genexpression und Steuerung des Zellstoffwechsels beteiligt sind. Um der Bildung aberranter, krankheitsverursachender DNA Modifikationen vorzubeugen, muss daher die Aktivität von Tet Proteinen präzise reguliert werden. In dieser Arbeit wurde das Potenzial von Proteinen mit Methyl-CpG-Bindedomäne untersucht, die Dioxygenase-Aktivität von Tet Proteinen in vitro und in vivo zu kontrollieren. Wir zeigen, dass vorzeitiges Binden von Mecp2 und Mbd2 an DNA 5mC vor Tet1-katalysierter Oxidation in Abhängigkeit ihrer Konzentration schützt. Der Mechanismus basiert auf kompetitiver, sequenzunspezifischer Bindung an DNA und korreliert mit der Abdeckung von Nukleinsäuren und der Verweildauer von MBD Proteinen an DNA. Folglich finden wir erhöhte Level des Tet Oxidationsprodukts 5hmC an perizentrischem Heterochromatin in Neuronen von Mecp2 defizienten Mäusen mit einhergehender Reaktivierung stark methylierter "major satellite DNA repeats". Darüber hinaus messen wir eine erhöhte Expression und Retrotransposition von endogenen und konstruierten "long interspersed nuclear elements" (LINE1) als mögliche Folge uneingeschränkter Tet Aktivität in humanen Zellen. RNA enthält, ähnlich wie DNA, eine Vielzahl post-synthetischer Modifikationen, die deren chemische Information und Eigenschaften erweitern. Eine von mehr als 100 nicht-kanonischen Ribonukleobasen ist C5-methyliertes Cytosin, das in unterschiedlichen RNA Typen, darunter ribosomaler RNA, vorhanden ist. Neuste Studien haben gezeigt, dass Tet Proteine nicht ausschließlich Methylcytosin von DNA, sondern auch 5mC einzelsträngiger RNA hydroxylieren. Da eine Modifikation ribosomaler RNA möglicherweise eine Lokalisation von Tet Proteinen im Nukleolus, dem Ort der rRNA Synthese und Zusammensetzung von Ribosomen, voraussetzt, ist es wichtig, die allgemeinen Prinzipien der gezielten nukleolaren Lokalisation von Proteinen und Peptiden zu verstehen. Hierfür haben wir die molekularen Anforderungen, die für eine Lokalisation und Akkumulierung im Nukleolus lebender Zellen notwendig und ausreichend sind, untersucht. Unsere Daten zeigen, dass Peptideinheiten aus aneinandergereihten, positiv geladenen Argininen mit einem isoelektrischen Punkt ≥ 12.6, die chemischen Bedingungen für eine nukleolare Lokalisation erfüllen. Diesem Prinzip entsprechend, identifizierten wir eine Arginin-reiche Region innerhalb des "low complexity inserts" von Tet2 Proteinen, die nach Deletion des regulatorischen N-terms im Nukleolus akkumulieren. Mit Hilfe eines pH-sensitiven Farbstoffs konnten wir visualisieren, dass der Nukleolus relativ sauer ist. Folglich zeigen wir, dass Peptide und Proteine mit hohem isoelektrischen Punkt, die unter diesen elektrochemischen Bedingungen eine positive Ladung tragen, mit negativ geladener RNA in vitro interagieren. Diese Interaktion erklärt wiederum die evolutionäre Konservierung dieses Lokalisationsprinzips von Insekten bis zum Mensch. Letztlich entwickelten wir ein Protokoll zur Visualisierung von Nukleoli in lebenden Zellen, wodurch die nukleolare Lokalisation unterschiedlicher Proteine, wie beispielsweise Tet, genau analysiert werden kann. Zusammenfassend tragen unsere Daten dem Verständnis der Tet Regulation außerhalb und der Lokalisation von (Tet) Proteinen innerhalb von Nukleoli bei.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Cell Biology and Epigenetics
Date Deposited: 23 May 2017 10:32
Last Modified: 23 May 2017 10:32
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-62449
Referees: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina and Süß, Prof. Dr. Beatrix
Refereed: 11 May 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6244
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