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Ligand binding and transmembranal signaling of the activating natural killer cell receptor NKp30

Memmer, Stefanie :
Ligand binding and transmembranal signaling of the activating natural killer cell receptor NKp30.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Ligand binding and transmembranal signaling of the activating natural killer cell receptor NKp30
Language: English
Abstract:

Natural killer cells (NK cells) are effector lymphocytes of the innate immune system, which are able to recognize and eliminate virus-infected and malignantly transformed cells. Therefore, they play an important role for the containment of pathophysiological processes. An understanding of the molecular mechanisms that lead to NK cell activation is crucial to enhance the effectivity of NK cell-based anti-cancer therapies. Effector functions are regulated by a variety of germline-encoded activating and inhibitory receptors on the surface of the NK cell. One of the major activating NK cell receptors is NKp30, belonging to the natural cytotoxicity receptors (NCRs). NKp30 is a functional receptor in humans and primates (macaques and chimpanzees) as well as on rat NK cell subsets. In contrast, it is only present as a pseudogene with two premature stop-codons in mouse. The only exception is the mouse strain Mus caroli, where two single nucleotide polymorphisms (SNPs) eliminate the premature stop-codons. The evolutionary reasons for the development of the murine NKp30 pseudogene are currently unknown. For signaling, NKp30 associates with immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-containing adaptor proteins like CD3ζ or FcεRIγ. Until now, the mechanism how ligand binding at the ectodomain of NKp30 is communicated to the adaptor protein CD3ζ is still unknown. Therefore, the molecular details of receptor activation as well as the role of the murine NKp30 pseudogene were analyzed in this thesis. Formerly, it was shown that the stalk domain of NKp30, a 15 amino acid sequence stretch between the immunoglobulin (Ig) domain and the transmembrane domain, is important for ligand binding and signaling. Therefore, in this thesis, mutated NKp30 variants were produced as full length receptors in A5-GFP reporter cells or NKp30::hIgG1-Fc (NKp30-Fc) fusion proteins in HEK 293T/17 cells and subsequently analyzed in binding studies (surface plasmon resonance, SPR) and signaling reporter assays. Surprisingly, analysis of NKp30/NKp46 tandem mutants showed that despite the existence of a conserved sequence motif in the membrane-proximal region, the stalk domains of NKp30 and NKp46 are not exchangeable without drastic deficiencies in folding, plasma membrane targeting and/or ligand-induced receptor signaling. Additionally, it was shown that the stalk domain of NKp30 is very sensitive to sequence alterations, as alanine substitution of any of the stalk amino acids led to impaired ligand binding and/or signaling capacity. Mutation of the arginine on amino acid position 143 to alanine (R143A) had the most drastic effect. Based on further mutational studies, N-glycosylation mapping and plasma membrane targeting studies, the existence of two interconvertible types of NKp30/CD3ζ complexes can be hypothesized: (1) a signaling incompetent structural NKp30/CD3ζ complex and (2) a ligand-induced signaling competent NKp30/CD3ζ complex. Furthermore, it can be proposed, that ligand binding at the Ig-fold of NKp30 triggers translocation of amino acid R143 of the stalk domain from the interface between membrane and extracellular region more deeply into the lipid bilayer to enable alignment with oppositely charged aspartate residues within CD3ζ and activation of CD3ζ signaling. Although several cellular and pathogen-derived NKp30 ligands have been identified in the last years, there is evidence for the existence of further, yet unknown cellular ligands. This assumption is based on former studies that showed binding of NKp30-Fc fusion proteins to tumor cell lines that do not express the cellular NKp30 ligands B7-H6 and BAG-6 on their surface. Therefore, in the present thesis, a screening method was established, based on transduction of ligand-bearing cell lines with a genome-wide shRNA library. After shRNA knockdown of putative ligands, cells were decorated with NKp30-Fc fusion proteins and sorted for reduced NKp30 ligand expression (fluorescence activated cell sorting, FACS). shRNA sequences were amplified from genomic DNA of the cells by PCR and subsequently analyzed via deep sequencing. The same screening method was additionally implemented for the identification of ligands of the other two NCRs, NKp44 and NKp46. Interestingly, inspite of the high number of advantages in contrast to conventional screening strategies, the existence of further cellular proteinaceous NCR ligands could not be confirmed with this screening. There are different suggestions about the evolutionary appearance of the NCRs. Divergence from a common ancestor (at least in case of NKp30 and NKp44) might have led to an increase in complexity and fine-tuning of the immune system. Different studies suggest development of the NKp46 gene from a common NCR ancestor or from a common ancestor with the KIR genes. Interestingly, murine NKp46 is a functional protein, while NKp30 is only present as a pseudogene and NKp44 is completely lost in mouse. To shed light on the evolutionary reasons for the development of the murine NKp30 pseudogene, the two premature stop codons in the extracellular domain of the M. musculus NKp30 gene sequence were repaired and the protein was expressed as full length receptor in A5-GFP reporter cells and as soluble mNKp30-Fc fusion protein in HEK 293T/17 cells. Interestingly, the full length receptor as well as the mNKp30-Fc fusion protein were intracellularly retained. Repair of the three N-linked glycosylation sites in the extracellular region of mNKp30 (mNKp30-glyco) led to the secretion of the Fc fusion protein, while the full length receptor stayed intracellularly retained. As shown previously, association with CD3ζ impacts plasma membrane targeting and retention of human NKp30. Therefore, failure of mNKp30 to assemble with CD3ζ might be the reason for intracellular retention of the full length receptor. Furthermore, the mNKp30-glyco-Fc fusion protein showed specific binding to P815 murine mastocytoma cells. This speaks for the existence of a cancer- or mast cell-related mNKp30-glyco ligand. Altogether, these were the first experiments to show expression and functional analysis of a putative mNKp30 on protein level. Based on these data, the present thesis provides deeper insight into the function of the major activating NK cell receptor NKp30. This might contribute to a better understanding of the molecular mechanisms that lead to NK cell activation, and this knowledge is crucial to enhance the effectivity of related treatments like anti-cancer and anti-viral therapies.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind Effektor-Lymphozyten des angeborenen Immunsystems. Sie zeichnen sich besonders durch die Fähigkeit aus, eine Vielzahl von Tumor- und Virus-infizierten Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Aus diesem Grund spielen sie eine wichtige Rolle bei der Eindämmung pathophysiologischer Prozesse. Ein Verständnis der molekularen Vorgänge, die zur NK-Zell-Aktivierung führen, ist wichtig für die Verbesserung der Effektivität von NK-Zell-basierten Krebstherapien. Die Erkennung von Zielzellen durch NK-Zellen wird über spezifische Oberflächenrezeptoren vermittelt, wobei die Aktivität der NK-Zellen durch antagonistisch wirkende aktivierende und inhibierende Signale reguliert wird. Einer der wichtigsten aktivierenden NK-Zell-Rezeptoren ist NKp30, welcher zu den Natürlichen Zytotoxizitäts-Rezeptoren (natural cytotoxicity receptors, NCRs) gehört. NKp30 ist sowohl in Menschen und Primaten (Makaken und Schimpansen) als auch auf bestimmten NK-Zell-Untergruppen in der Ratte ein funktionaler Rezeptor. Im Gegensatz dazu ist es in der Maus nur als Pseudogen mit zwei vorzeitigen Stop-Codons vorhanden. Die einzige Ausnahme ist der Maus-Stamm Mus caroli, in dem zwei Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNPs) die vorzeitigen Stop-Codons eliminieren. Die Gründe für die Entwicklung des NKp30 Pseudogens in der Maus sind derzeit unbekannt. Für die Signalweiterleitung assoziiert NKp30 mit Adapter-Proteinen die intrazelluläre Immunrezeptor-Tyrosin-basierte Aktivierungsmotive (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAMs) tragen (CD3ζ und FcεRIγ). Bisher sind die Ligandenbindung und die nachfolgende Rezeptor-Aktivierung, sowohl im Hinblick auf die Art der Liganden als auch auf die initialen Schritte der Signalweiterleitung an das Adapter-Protein, unzureichend verstanden. Daher sollten diese molekularen Mechanismen, sowie die Rolle des NKp30 Pseudogens in der Maus in der vorliegenden Arbeit genauer untersucht werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Stalk-Domäne von NKp30, ein 15 Aminosäuren langer Sequenzbereich zwischen der Immunglobulin (Ig) Domäne und der Transmembran-Domäne, wichtig für die Liganden-Bindung und die Signalweiterleitung ist. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit mutierte Varianten des NKp30 Rezeptors als Volllängen-Proteine in A5-GFP Reporterzellen und als NKp30::hIgG1-Fc (NKp30-Fc) Fusionsproteine in HEK 293T/17 Zellen produziert und auf ihre Fähigkeit zur Liganden-Bindung (Oberflächenplasmonresonanz [surface plasmon resonance, SPR] Experimente) und Signalweiterleitung (Reporterassays) untersucht. Überraschenderweise zeigten Analysen von NKp30/NKp46 Tandem Mutanten, dass die Stalk Domänen beider Rezeptoren, trotz der Existenz eines konservierten Sequenz-Motivs in der Membran-nahen Region, ohne drastische Beeinträchtigungen von Faltung, Plasmamembran-Targeting und/oder Liganden-induzierter Signalweiterleitung nicht austauschbar sind. Zusätzlich zeigte sich, dass Änderungen der Aminosäure Sequenz der Stalk Domäne starke Auswirkungen auf die Funktionalität des Rezeptors haben, da ein Aminosäure Austausch durch Alanin an jeder Stelle der Stalk Domäne zu einer Beeinträchtigung der Liganden-Bindung und/oder der Fähigkeit zur Signalweiterleitung führte. Die gravierendsten Auswirkungen hatte die Mutation von Arginin zu Alanin an Aminosäure Position 143 (R143A). Basierend auf den Ergebnissen weiterer Mutationsstudien, N-Glykosylierungskartierung (N-glycosylation mapping) und Ko-Expressionsstudien in HeLa Zellen kann die Existenz von zwei unterschiedlichen Typen von NKp30/CD3ζ Komplexen postuliert werden: (1) ein nicht zur Signalweiterleitung fähiger, struktureller NKp30/CD3ζ Komplex und (2) ein durch Liganden-Bindung induzierter, zur Signalweiterleitung fähiger NKp30/CD3ζ Komplex. Des Weiteren kann angenommen werden, dass die Liganden-Bindung an der Immunglobulin (Ig)-Domäne von NKp30 zu einer Translokation der Stalk-Aminosäure R143 von der Grenzfläche zwischen Membran und extrazellulärer Region zu einer tiefer in der Lipid-Doppelschicht liegenden Position führt. Dies ermöglicht eine Interaktion zwischen R143 und den entgegengesetzt geladenen Aspartat-Resten des CD3ζ-Proteins und damit die Aktivierung der Signalweiterleitung durch CD3ζ. Obwohl in den letzten Jahren mehrere zelluläre und Pathogen-assoziierte NKp30-Liganden identifiziert wurden, ist die Existenz weiterer, bisher unbekannter zellulärer Liganden möglich. Diese Annahme basiert auf der Tatsache, dass frühere Studien die Bindung von NKp30-Fc Fusionsproteinen an Krebs-Zelllinien zeigten, die keinen der beiden bekannten zellulären NKp30-Liganden (B7-H6 und BAG 6) auf ihrer Oberfläche trugen. Auf Grund dessen sollte in der vorliegenden Arbeit die Existenz weiterer Protein-Liganden genauer untersucht werden. Hierfür wurde eine Screening-Methode etabliert, welche auf der Transduktion von Liganden-tragenden Zelllinien mit einer genom-weiten shRNA Bibliothek basiert. Nach dem knockdown der putativen Liganden durch die shRNAs wurden die Zellen mit NKp30-Fc Fusionsproteinen dekoriert und Zellen mit reduzierter NKp30-Liganden-Expression mittels Fluoreszenz-aktivierter Zell-Sortierung (fluorescence activated cell sorting, FACS) angereichert. Die shRNA Sequenzen wurden anschließend durch PCR aus der genomischen DNA der angereicherten Zellen amplifiziert und mittels Deep sequencing analysiert. Die selbe Screening Methode wurde auch zur Identifizierung von Liganden für die anderen beiden NCRs NKp44 und NKp46 eingesetzt. Interessanterweise konnten trotz diverser Vorteile dieser Screening Methode keine weiteren zellulären Protein-Liganden für die NCRs identifiziert werden. Über das evolutionäre Auftreten der NCRs gibt es unterschiedliche Ansichten. Die Entwicklung aus einem gemeinsamen NCR-Vorläufer-Gen (zumindest im Fall von NKp30 und NKp44) könnte zu einer Erhöhung der Komplexität und Spezialisierung einzelner Komponenten des Immunsystems geführt haben. Studien halten sowohl die Entwicklung des NKp46 Gens aus einem gemeinsamen NCR-Vorläufer als auch aus einem gemeinsamen Vorläufer mit den KIR Genen für möglich. Interessanterweise ist murines NKp46 ein funktionales Protein, während NKp30 nur als Pseudogen und NKp44 gar nicht in der Maus vorkommt. Um die evolutionären Gründe zu verstehen, die zur Entwicklung des murinen NKp30 (mNKp30) Pseudogens führten, wurden die zwei vorzeitigen Stop-Codons in der extrazellulären Domäne der M. musculus Gen-Sequenz repariert und das Protein als Volllängen-Rezeptor in A5-GFP Zellen sowie als mNKp30-Fc Fusionsprotein in HEK 293T/17 Zellen produziert. Interessanterweise wurden sowohl der Volllängen-Rezeptor als auch das mNKp30-Fc Fusionsprotein intrazellulär zurückgehalten. Eine Reparatur der drei fehlenden N-Glykosylierungsstellen in der extrazellulären Region von mNKp30 (mNKp30-glyco) führte zur Sekretion des Fc-Fusionsproteins, während der Volllängen-Rezeptor weiterhin intrazellulär zurückgehalten wurde. Wie in vorherigen Studien und auch in der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, beeinflusst die Assoziation mit CD3ζ die Verweilzeit des humanen NKp30 Rezeptors auf der Plasmamembran (Targeting und Retention). Daher kann die intrazelluläre Lokalisation des mNKp30 Proteins möglicherweise dadurch erklärt werden, dass der Rezeptor nicht in der Lage ist mit CD3ζ zu assoziieren. Des Weiteren zeigte das mNKp30-glyco-Fc Fusionsprotein eine spezifische Bindung an P815 Maus Mastozytom Zellen. Dies spricht für die Existenz eines Tumor- oder Mastzell-spezifischen mNKp30-glyco Liganden. Insgesamt waren dies die ersten Experimente zur Expression und Funktionsanalyse eines putativen mNKp30 Rezeptors auf Protein-Ebene. Basierend auf diesen Daten liefert die vorliegende Arbeit tiefere Einblicke in die Funktion des aktivierenden NK Zell-Rezeptors NKp30. Dies trägt zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen bei, die zur Aktivierung von NK Zellen führen. Dieses Wissen ist wichtig für die zukünftige Entwicklung und Verbesserung von NK-Zell-basierten antiviralen und Krebs-Therapien.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 23 May 2017 10:40
Last Modified: 23 May 2017 10:40
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-62360
Referees: Koch, Prof. Dr. Joachim and Süß, Prof. Dr. Beatrix and Laube, Prof. Dr. Bodo
Refereed: 12 May 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6236
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