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Strukturelle Untersuchung Histon-Deacetylase-ähnlicher Enzyme aus Pseudomonas aeruginosa

Krämer, Andreas :
Strukturelle Untersuchung Histon-Deacetylase-ähnlicher Enzyme aus Pseudomonas aeruginosa.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Strukturelle Untersuchung Histon-Deacetylase-ähnlicher Enzyme aus Pseudomonas aeruginosa
Language: German
Abstract:

In der vorliegenden Arbeit wurden die drei Enzyme PA0321, PA1409 und PA3774 aus dem Humanpathogen Pseudomonas aeruginosa untersucht. Alle drei Enzyme gehören zur Histon-Deacetylase-Superfamilie (HDAC) und waren anhand von Sequenzanalysen als putative Acetylpolyamin-Aminohydrolasen (APAH) vorhergesagt. Das Hauptaugenmerk der Arbeit lag auf der strukturellen Aufklärung dieser Enzyme mithilfe der Kristallstrukturanalyse. Die daraus gewonnenen Informationen, sollten dazu dienen potente und selektive Inhibitoren zu entwickeln, da angenommen wurde, dass eine Inhibition dieser Enzyme dazu beitragen könnte, bakterielle Infektion besser zu bekämpfen. Eine enzymatische Analyse der Enzyme bestätigte die Vorhersage, dass es sich bei den Enzymen PA1409 und PA0321 um APAHs handelt. Im Gegensatz dazu zeigte das Enzym PA3774 keinen signifikanten Umsatz von acetylierten Polyaminen. Die hohen Umsatzraten von artifiziellen HDAC-Substraten lassen darauf schließen, dass acetylierte Proteine die eigentlichen Substrate dieses Enzyms sind. Im weiteren Verlauf gelang es die Struktur des Enzyms PA3774 aufzuklären. Neben der nativen Struktur konnten zusätzlich Enzym-Ligand-Komplexe in hoher Auflösung determiniert werden, die detaillierte Einblicke in das Bindungsverhalten der Liganden geben. Wie sich herausstellte, zeigt PA3774 eine hohe strukturelle Ähnlichkeit mit der Histon-Deacetylase-ähnlichen Amidohydrolase (FB188-HDAH) aus Bordetella/Alcaligenes und sollte treffender als HDAH anstatt als APAH klassifiziert werden. Zum besseren Verständnis und Vergleich dieser beiden Proteine wurde die Kristallisation der FB188-HDAH reproduziert und es konnten verschiedene neue Enzym-Ligand-Komplexe erhalten werden. Beide Enzyme zeigen eine analoge Tetramerisierung, deren spezifische Assemblierung den Bindungskanal entscheidend beeinflusst. Aufgrund dessen ist anzunehmen, dass diese Quartärstruktur eine essenzielle Funktion besitzt. Zwar gelang die Kristallisation von PA0321 und PA1409 im Rahmen dieser Arbeit nicht, jedoch ist die Struktur der eng verwandten APAH aus M. ramosa bereits bekannt. Ein Vergleich der HDAH und APAH Enzyme zeigt gravierende Unterschiede hinsichtlich ihrer Quartärstruktur, was eine plausible Erklärung für ihre unterschiedlichen Substratselektivitäten liefert. Zusätzlich wurden an zwei Nebenprojekten gearbeitet. Im Ersten wurden vielversprechende photoschaltbare Inhibitoren auf bakterielle sowie menschliche HDAC-Enzyme untersucht. Hierbei zeigten die Inhibitoren in ihrer metastabilen cis-Konfiguration eine um bis zu 10-fach erhöhte Wirkung Inhibition im Vergleich zur thermostabileren trans-Konfiguration. Solche photoschaltbaren Inhibitoren eröffnen einen Weg hin zu zielgerichteten nebenwirkungsärmeren Chemotherapien. In einem weiteren Nebenprojekt wurde ein neuartiger Fluoreszenzlebensdauer-Bindungs-Assay entwickelt, der es ermöglicht im Hochdurchsatzverfahren große Substanzbibliotheken zu testen und Inhibitoren für diese Enzymklasse zu finden. Darüber hinaus können Bindungskonstanten von Inhibitoren unabhängig von der Enzymaktivität bestimmt werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The present thesis characterizes the enzymes PA0321, PA1409, and PA3774 from the human pathogen Pseudomonas aeruginosa. All are members of the histone deacetylase (HDAC) superfamily and have been predicted to be putative acetylpolyamine-amidohydrolases (APAHs). Notably, an inhibition of these enzymes has been suggested as a potential remedy against P. aeruginosa infections. The main focus of the thesis was to solve the enzymes' structures by X-ray crystallography in order to develop specific and potent inhibitors. Enzymatic analyses revealed that only PA0321 and PA1409 were actual APAHs, whereas PA3774 showed no significant turnover rates for acetylated polyamines. However, the high activity of this enzyme for artificial histone deacetylase substrates suggests that the native substrates are acetylated proteins. The structure of the protein PA3774 was solved at atomic resolution. Apart from the native enzyme, other ligand-enzymes-complexes were determined that provided detailed insights into particular ligand interactions. The structure of this protein was found to be homolog to an enzyme called histone deacetylase-like amidohydrolase (FB188-HDAH) from Bordetella/Alcaligenes, suggesting that PA3774 should be classified as a HDAH rather than an APAH. For a better understanding and comparison of PA3774 and FB188-HDAH, the crystallization of the FB188-HDAH was reproduced and novel inhibitor-enzymes complexes were determined. A closer investigation revealed an unusually elongated L1-Loop to be responsible for a unique tetramerization in both enzymes with direct influence on the entrance tunnel to the enzyme's catalytic center. This then lead to the hypothesis that the assembly is crucial for substrate recognition and selectivity. Moreover, the biological assembly is strikingly different in comparison to the APAH from M. ramosa, an enzyme that is closely related to PA1409 and PA0321. The distinct structural differences between HDAH and APAH enzymes thus provide a plausible explanation for their diverging substrate selectivities. In addition, two side projects were conducted. In the first one, a new fluorescence lifetime binding assay was developed. The assay is suitable for high throughput screening applications as well as to determine binding constants of inhibitors. The second side project tested photo-switchable inhibitors on bacterial and human HDACs with promising results. In some cases the inhibition of the metastable cis-state was up to 10 times stronger than the thermostable trans-state. Given the fact that human HDACs are known targets in cancer treatment, such inhibitors may ultimately lead chemo therapies with fewer side-effects.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
Date Deposited: 12 Apr 2017 06:03
Last Modified: 12 Apr 2017 06:03
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-61348
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Meyer-Almes, Prof. Dr. Franz-Josef and Sippl, Prof. Dr. Wolfgang
Refereed: 5 April 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6134
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