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Investigation of a NKG2D-dependent tumor immune escape mechanism of head and neck squamous cell carcinoma and proof of concept of a clinical intervention strategy

Weil, Sandra :
Investigation of a NKG2D-dependent tumor immune escape mechanism of head and neck squamous cell carcinoma and proof of concept of a clinical intervention strategy.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Investigation of a NKG2D-dependent tumor immune escape mechanism of head and neck squamous cell carcinoma and proof of concept of a clinical intervention strategy
Language: English
Abstract:

Natural killer cells are large granular lymphocytes of the innate immune system, which play an important role in the recognition and elimination of malignantly transformed and infected cells. The major activating NK cell receptor NKG2D, which is also expressed as co-stimulatory receptor on T cell subsets, is thereby a key modulator for tumor recognition and immune cell cytotoxicity. NKG2D recognizes several structurally related cellular ligands (MICA, MICB and ULBP1-6) commonly overexpressed on tumor cells. However, soluble NKG2D (sNKG2D) ligands released from malignant cells by proteolytical shedding, or on exosomes, can inhibit NKG2D-dependent NK and T cell cytotoxicity. Consequently, previous studies showed a correlation of elevated individual sNKG2D ligand plasma levels with impaired NK cell cytotoxicity in cancer patients. Moreover, in a phase I/II trial with high-risk neuroblastoma patients, sMICA was shown to inhibit not only autologous NK cells, but also adoptively transferred allogeneic NK cells after haploidentical stem cell transplantation. Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a highly heterogeneous and aggressive tumor of the upper aero-digestive tract accounting for 300,000 annual deaths worldwide due to failure of current therapies. In a previous study, sMICA in HNSCC patients’ plasma was correlated with impaired NK cell function, indicating that NKG2D-dependent tumor immune escape might play a role for evasion of HNSCC from immunosurveillance. However, little is known about the cumulative role of all sNKG2D ligands and their impact during course of disease. Therefore, the aim of this thesis was the characterization of the NKG2D-dependent tumor immune escape in HNSCC to identify a patient cohort, which might benefit from restoration of NKG2D-dependent tumor immunosurveillance. In this respect, a proof of concept for the depletion of sNKG2D ligands from patients’ plasma as future therapeutic intervention strategy to restore NKG2D-dependent antitumor immune cell function was established. In this thesis, profiling of the plasma from 44 HNSCC patients in comparison to age-matched healthy donors revealed significantly elevated levels of sMICA, sMICB and sULBP1-3. The cumulative levels of sNKG2D ligands were patient specific and correlated with disease progression and tumor load. Moreover, these data suggested a prominent role of sULBP1 and sULBP3 in NKG2D-dependent tumor immune escape in HNSCC. In addition, the immunosuppressive state of HNSCC patients augments NKG2D-dependent escape especially through high plasma levels of TGF-β1. In in vitro cytotoxicity assays, high levels of sNKG2D ligands and TGF-β1 in patients’ plasma correlated with NK cell inhibition by blocking the NKG2D receptor. Importantly, the specific depletion of sNKG2D ligands by antibody-coupled magnetic beads successfully restored NK cell cytotoxicity of primary human NK cells against single tumor cell suspensions and in a 3D tumor spheroid model. Consequently, all sNKG2D ligands are indicative for NKG2D-dependent tumor immune escape in HNSCC and determine a time point at which malignant cells critically benefit from bypassing immunosurveillance. Based on tumor spheroids, it could be shown that inhibition of NKG2D-dependent cytotoxicity correlated with drastically reduced NK cell infiltration. These data were in accordance with low infiltration frequencies found in primary tumors of HNSCC patients. Therefore, interference with NKG2D-dependent tumor immune escape might boost both, NK cell cytotoxicity and redirect NK cells to infiltrate tumors. As proof of concept, a biofunctionalized matrix for adsorption apheresis based on a monoclonal antibody for the representative ligand MICA was generated and showed high depletion capacity of soluble MICA allelic variants from human plasma in vitro. The data from HNSCC patients indicate that the simultaneous depletion of all sNKG2D ligands might be crucial for a clinical intervention strategy. Therefore, a pan-specific bioreactive surface using recombinant human IgG1-Fc fusion proteins of the NKG2D ectodomain was generated. In vitro depletion experiments demonstrated quantitative depletion of sMICA/B and sULBPs from human plasma. To validate adsorption apheresis of sNKG2D ligands, the anti-MICA antibody adsorber was used in a proof of concept study in rhesus monkeys (Macaca mulatta). The pre-clinical study in rhesus monkeys infused with soluble human MICA demonstrated that adsorption apheresis of sNKG2D ligands is technically feasible and that quantitative removal of sMICA can be achieved after three plasma volume exchanges. In conclusion, the cumulative level of sNKG2D ligands and TGF-β1 might provide a novel diagnostic and/or prognostic marker combination to decipher a patient cohort, which benefits from restoration of NKG2D-dependent tumor immunosurveillance. Adsorption apheresis of sNKG2D ligands is proposed as therapeutic intervention strategy to improve the efficacy of autologous immune cells by restoration of tumor infiltration and cytotoxicity. Furthermore, ad-sorption apheresis as preconditioning strategy combined with cellular immunotherapies might help to improve the efficacy of therapeutically administered wildtype or engineered cytotoxic lymphocytes.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) des angeborenen Immunsystems sind große granuläre Lymphozyten die maßgeblich an der Immunabwehr von transformierten und infizierten Zellen beteiligt sind. Die Erkennung und Zerstörung dieser Zellen wird durch die relative Intensität von agonistischen und antagonistischen Signalen Keimbahn-kodierter aktivierender und inhibitorischer Rezeptoren reguliert. Für die Zerstörung von Tumorzellen durch NK-Zellen spielt dabei der aktivierende NKG2D-Rezeptor eine wichtige Rolle. Neben NK-Zellen exprimieren auch verschiedene T Zellsubtypen NKG2D als ko-stimulierenden Rezeptor. Die Liganden von NKG2D sind die strukturell verwandten Tumorantigene MICA, MICB und ULBP1-6, die auf der Oberfläche von Tumorzellen überexprimiert werden. Hochmaligne Tumore können jedoch die NKG2D-vermittelte Immunabwehr durch einen Tumor-Immun-Escape-Mechanismus basierend auf der Freisetzung löslicher NKG2D-Liganden durch proteolytische Spaltung (oder auf der Oberfläche von freigesetzten Exosomen) überwinden. Die molekularen Konsequenzen der Freisetzung von NKG2D-Liganden sind vielfältig: 1.) Die Zahl der Liganden auf der Zelloberfläche wird reduziert und somit die Anzahl der Interaktionsstellen für NKG2D+ Immunzellen, und 2.) lösliche Liganden können an den NKG2D-Rezeptor binden und führen zur Blockierung und Degradation des Rezeptors auf den Immunzellen. Somit vermindern lösliche NKG2D-Liganden maßgeblich die zytotoxische Aktivität von NKG2D+ Immunzellen. Folglich zeigten verschiedene Studien einen Zusammenhang zwischen verringerter NK-Zellfunktionalität und erhöhten Plasmakonzentrationen einzelner NKG2D-Liganden bei Patienten mit verschiedenen Tumorentitäten. Dies betrifft neben den autologen Immunzellen aber auch die im Rahmen einer Zelltherapie transferierten NKG2D+ Immunzellen wie bei einer NK-Zelltherapie nach haploidenter Stammzelltransplantation in einer klinischen Phase I/II Studie bei Patienten mit Hochrisiko-Neuroblastom im Zusammenhang mit löslichem MICA gezeigt wurde. Das Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereiches (head and neck squamous cell carcinoma; HNSCC) ist ein solider und hochaggressiver Tumor, der aus den Epithelien des oberen Atemwegs- und Verdauungstraktes hervorgeht. HNSCC steht mittlerweile an sechster Stelle der Malignomerkrankungen mit jährlich über 650.000 neuen Fällen weltweit. Die 5-Jahres Überlebensrate liegt seit langem unverändert bei 40-50% und hat somit 300.000 Todesfälle pro Jahr zur Folge. Eine vorangegangene Studie konnte auch im Plasma von HNSCC Patienten erhöhte Werte an sMICA nachweisen. Daher ist davon auszugehen, dass der NKG2D-vermittelte Tumor-Immun-Escape auch für diese Krebsart von Bedeutung ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung des NKG2D-abhängigen Tumor-Immune-Escape-Mechanismus bei Patienten mit HNSCC und die Etablierung eines Aphereseverfahrens als therapeutische Interventionsstrategie zur Entfernung der löslichen NKG2D-Liganden aus dem Patientenplasma. Die Analyse der Plasmen von 44 HNSCC Patienten zeigte signifikant erhöhte Level der löslichen NKG2D-Liganden MICA/B und ULBP1-3 im Vergleich zu alterskorrelierten Gesundspendern. Dabei korrelierten die kumulativen Plasmalevel mit dem Krankheitsverlauf und der Tumorlast. Im Vergleich zu MICA/B konnten die löslichen Liganden ULBP1/3 als mögliche Hauptmediatoren des Tumor-Immun-Escapes bei HNSCC identifiziert werden. Die weitergehende Analyse von immunsuppressiven Faktoren zeigte zudem signifikant erhöhte TGF-β1 Plasmawerte, die zur Hemmung der NKG2D-vermittelten Immunabwehr beitragen. In funktionalen in vitro Analysen wurde die Zytotoxizität von primären humanen NK-Zellen in Folge der Blockierung des NKG2D-Rezeptors durch lösliche NKG2D-Liganden und TGF-β1 im Patientenplasma deutlich inhibiert. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass eine spezifische Entfernung der löslichen NKG2D-Liganden, mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern, die Zytotoxizität der NK-Zellen gegenüber Tumorzellen in Suspension und im 3D Tumorsphäroid-Modell nahezu vollständig wiederherstellen konnte. Folglich ist das Level an löslichen NKG2D-Liganden ein Indikator für das Ausmaß, in dem Tumore der NKG2D-vermittelten Immunabwehr entgehen. In Infiltrationsstudien im Tumorsphäroid-Modell konnte nachgewiesen werden, dass die Inhibition der NKG2D-vermittelten Zytotoxizität gegenüber den Tumorsphäroiden mit einer stark verminderten NK-Zellinfiltration korrelierte. Die Daten der Tumorsphäroide spiegeln die Situation in Patienten wieder. In weitergenden Studien an primären Tumoren von HNSCC Patienten konnte ebenfalls eine strak verminderte oder abwesende NK-Zellinfiltration nachgewiesen werden. Daher ist davon auszugehen, dass die Intervention mit dem Tumor-Immun-Escape sowohl zytotoxische als auch Infiltrations-Eigenschaften von NK-Zellen deutlich verbessern kann. Zur Entfernung von löslichen NKG2D-Liganden aus Patientenplasma wurde ein Plasmaphereseverfahren entwickelt. Hierzu wurde, als proof of concept, eine biofunktionalisierte Oberfläche basierend auf der Kopplung monoklonaler Antikörper gegen den repräsentativen Liganden MICA generiert, die eine hohe Depletionseffizienz für verschiedene MICA Allele aus humanem Plasma in vitro aufwies. Bei der Untersuchung der löslichen NKG2D-Liganden im Patientenplasma zeigte sich jedoch eine individuelle Zusammensetzung der Plasmaspiegel. Für eine therapeutische Intervention könnte folglich die simultane Entfernung mehrerer löslicher NKG2D-Liganden aus Patientenplasma notwendig werden. Aus diesem Grund wurden in einem zweiten Ansatz Fusionsproteine aus einem humanen IgG1-Fc-Teil und der Ektodomäne des NKG2D-Rezeptors als panspezifischer Adsorber entwickelt. Dabei bindet der an die Matrix gekoppelte Rezeptor die löslichen NKG2D-Liganden mit der gleichen Effizienz wie der Rezep-tor auf den NK-Zellen und verhindert somit die Auswirkungen des Tumor-Immun-Escape-Mechanismus. Die Apherese ist folglich unabhängig vom jeweiligen Patientenstatus bzw. dem Expressionslevel der Liganden effizient durchführbar. Die an eine Matrix gekoppelten NKG2D-Fusionsproteine konnten alle löslichen NKG2D-Liganden effizient aus humanem Plasma in vitro entfernen. Zur Validierung der Apherese wurde der Antikörper-basierte Adsorber als proof of concept in einem Rhesusaffen (Macaca mulatta) Modell mit injiziertem löslichen, humanem MICA getestet. Die präklinische Studie zeigte, dass die Apherese von löslichen NKG2D-Liganden aus dem Plasma eines Organismus technisch praktikabel ist und eine quantitative Entfernung des löslichen MICAs bereits nach dreimaligem Plasmaaustausch durch den Adsorber erfolgte. Zusammenfassend konnten die löslichen NKG2D-Liganden und TGF-β1 als eine neue prognostische und/oder diagnostische Tumormarker-Kombination für HNSCC identifiziert werden. Die Tumormarker könnten zur Identifikation einer Patientengruppe dienen, die von einer Interventionsstrategie zur Überwindung des NKG2D-vermittelten Tumor-Immun-Escape zur Steigerung der anti-tumoralen Eigenschaften autologer Immunzellen profitieren kann. In diesem Zusammenhang stellt die Apherese löslicher NKG2D-Liganden ein vielversprechendes therapeutisches Konzept dar, das in Kombination mit Immunzelltherapien auch zur Steigerung der Effizienz allogener Immunzellen sowie genetisch modifizierter (autologer/allogener) Immunzellen beitragen kann.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 02 Feb 2017 10:29
Last Modified: 14 Feb 2017 09:17
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-59149
Referees: Koch, Prof. Dr. Joachim
Refereed: 13 December 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5914
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