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Development of bioorthogonal synthetic strategies towards hybrid macromolecular conjugates with tailored properties

Uth, Christina :
Development of bioorthogonal synthetic strategies towards hybrid macromolecular conjugates with tailored properties.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2016)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Development of bioorthogonal synthetic strategies towards hybrid macromolecular conjugates with tailored properties
Language: English
Abstract:

Über die letzten Jahrzehnte wurde eine große Anzahl von chemischen Reaktionen entwickelt, die kompatibel mit bioinspirierten, biotechnologischen und biomimetischen Molekülen sind und den gegenwärtigen Anforderungen des kontinuierlich wachsenden Repertoires von Konjugationstechniken entsprechen. Die Wahl des geeigneten Ansatzes aus der Toolbox der sogenannten bioorthogonalen Methoden ist allerdings immer einzelfallabhängig. Das zentrale Ziel der vorgestellten kumulativen Arbeit war deshalb die Konzeption und Entwicklung von neuen kombinierten „orthogonalen bioorthogonalen“[1] Synthesestrategien, d.h. die Entwicklung von bestimmten chemo- und regioselektiven Reaktionen für die Synthese von makromolekularen Konjugaten mit maßgeschneiderten Eigenschaften. Dazu wurde eine Vielzahl von Verbindungen aus verschiedenen molekularen Klassen untersucht, darunter kleine Zytotoxine und Oligopeptide, hoch geordnete kubisch-oktamerische Silsesquioxane (COSS), kristalline Nanocellulose und funktionelle Proteine. Für jedes, in dieser Arbeit beschriebene Konjugat wurde eine individuelle bioorthogonale Synthesestrategie entwickelt, die die intrinsischen Eigenschaften, speziellen Anforderungen und verschiedenen Restriktionen der jeweiligen Reaktionspartner berücksichtigt. Um eine tragfähige und reproduzierbare Syntheseplattform zu etablieren, wurden drei eigenständige Studien durchgeführt, die jeweils eine Reihe von selektiven chemischen Reaktionen zwischen speziellen funktionellen Molekülen mit den jeweiligen Gegenstücken enthielten. Unter Berücksichtigung, dass Bio-(makro)moleküle sehr komplex und vielfältig sind, sollte der Konjugationsansatz die erforderliche Bioorthogonalität, sowie Flexibilität hinsichtlich Effizienz, Erschwinglichkeit und Leichtigkeit des Zugangs bieten. Jede individuelle Studie im Rahmen dieser Arbeit adressierte die Kupplung von zwei oder mehr molekularen Strukturen zur Erzeugung molekularer definierter Konstrukte. Alle drei vorgestellten Studien enthielten drei wesentliche Zielsetzungen: - das Design eines Strukturgerüst-Liganden Systems; - die Ausarbeitung/Konzeption und Anwendung einer speziellen Synthesestrategie; - die Untersuchung der Bioaktivität, falls erforderlich. Das Ziel der ersten Studie war die Immobilisierung von Proteinen unterschiedlicher Größe und Komplexität auf ein kristallines Nanocellulose Strukturgerüst. Als Liganden wurden drei Biomakromoleküle ausgewählt: ein grün- fluoreszierendes Protein, ein Enzym, Galaktose Oxidase und ein anti-Lysozym Haiantikörper. Die spezifischen Konjugate sollten die Eigenschaften der immobilisierten Proteinen mit den intrinsischen Charakteristika der Cellulose Nanokristalle, wie niedrige Toxizität, Wasser- und Biokompatiblität sowie die, durch ihr nanoskaliges Format bedingten offensichtlichen Vorteile, vereinen. Die zweite Arbeit zielte auf die Entwicklung einer tragfähigen Strategie für die Biofunktionalisierung eines der kleinsten bekannten Nanopartikel, kubisch-oktamerische Silsequioxane (COSS), mit Peptiden. Zunächst sollte eine Vorstudie für die passende Konjugationsplattform mit verschiedenen peptidischen Reaktionspartnern durchgeführt werden. Peptide von unterschiedlicher Länge und Architektur wurden untersucht, darunter eine enzymatische Erkennungssequenz, Cystin-Knoten Miniproteine, ein Integrin bindendes und ein antimikrobielles Peptid, sowie ein Inhibitor einer therapeutischen Protease. Das Design der Synthese, vor allem die Wahl eines geeigneten bioorthogonalen Verfahrens sollte unter der Prämisse erfolgen, dass das COSS-Gerüst in Gegenwart von bestimmten Nukleophilen instabil ist Die dritte Studie war auf die Synthese eines Wirkstofftransportmoduls fokussiert, das aus einem kubisch-oktamerisches Silsesquioxan (COSS) Gerüstmolekül mit zellpenetrierenden Eigenschaften und Doxorubicin, ein cytotoxischen Anthracyclin Antibiotikum, besteht. Dieses komplexe Konstrukt sollte die Zellaufnahme des Wirkstoffes erleichtern und diesen in der Zelle freisetzen. Die Einschränkungen bezüglich der Stabilität des COSS-Gerüstes sollten ebenfalls berücksichtigt werden.Die erste Studie (Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 12618-12623) adressierte die Entwicklung eines ortsgerichteten, bioorthogonalen und modularen Syntheseansatzes für die Immobilisierung von Biomolekülen auf einer kristallinen Nanocellulose (CNC) Plattform. Das ultimative Ziel war die kovalente, chemoselektive Immobilisierung von bioaktiven Proteinen auf der Oberfläche von CNC – einer nachhaltigen, natürlichen makromolekularen Verbindung. Die Herausforderung dieser Studie war, die allgemeinen Nachteile der üblicherweise verwendeten Proteinkonjugationsmethoden bezüglich verbesserter Selektivität und Einsatz unter physiologischen Bedingungen in wässrigem Milieu zu vermeiden. Zu diesem Zweck wurde ein generisches Zweistufenverfahren entwickelt, das auf einer Reihe von effizienten orthogonalen Reaktionen basiert, die Notwendigkeit von organischen Lösungsmitteln vermeidet und dadurch kompatibel mit physiologischen Systemen ist. Unter Verwendung von effizienter Oximligation und anschließender Sortase-vermittelter Konjugation zeigte die Synthesestrategie die erforderliche Regiospezifität und Biokompatibilität, die die Anwendung auf eine große Anzahl von funktionellen Proteinen ermöglicht. Durch die TEMPO-vermittelte Oxidation der oberflächenexponierten CNC-Hydroxylgruppen konnte zunächst ein kleiner Fluorophor immobilisiert werden, der die Detektion von Aminooxy-adressierbaren Oberflächenaldehyden ermöglichte. Die anschließende Oximierung mit dem peptidischen Linker wurde validiert und führte zu Sortase A adressierbaren Positionen auf dem CNC-Träger. Anschließend wurde die Enzym-vermittelte Oberflächenimmobilisierung mit drei Proteinen aus unterschiedlichen Klassen, von verschiedener Größe, Komplexität und Bioaktivität unter Erhalt ihrer biologischen Funktion durchgeführt. In dieser Arbeit wurde, aufgrund erhöhter katalytischer Eigenschaften, eine gentechnisch mutierte Variante der Sortase A (eSrtA) verwendet. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die definierte Orientierung durch die ortsselektive Kupplung der Proteinliganden, im Vergleich zu zufällig immobilisierten Proteinen, in einer verbesserten Bioaktivität resultierte. Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnisse, kann zusammenfassend gesagt werden, dass diese nachhaltigen, nanoskaligen Biomaterialien eine exzellente Plattform für die spezifische Immobilisierung von anspruchsvollen Makromolekülen für biomedizinische Zwecke, Wirkstofftransport oder –ablagerung darstellen. Die zweite Studie (Chem. Commun., 2015, 51, 11130-11133) widmete sich der Entwicklung einer Synthesestrategie für die Generierung eines hybriden organisch-anorganischen Konstruktes, unter Verwendung eines der kleinsten bekannten kubisch-oktamerischen Nanopartikel (COSS) und eines funktionellen, peptidischen Konjugationspartners. In den Proof-of-Concept Experimenten wurde die Anwendbarkeit des modularen synthetischen Ansatzes, der die Generierung von N-terminalen Peptidaldehyden, effiziente Oximligation und Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (DARinv) kombiniert, anhand der Konjugationen von linearen, Cystin-cyclisierten und multi-Disulfid-verbrückten funktionellen Peptiden demonstriert. Zusätzlich wurde die Strategie auf die Synthese von Konstrukten mit komplexen Strukturen erweitert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (DARinv) wegen ihrer Biokompatibilität und schnellen Reaktionskinetik für die Synthese von Biokonjugaten, bestehend aus Peptiden mit unterschiedlicher Länge, molekularer Komplexität und biologischen Eigenschaften, ausgewählt. Zudem hat diese spezielle Reaktion den Vorteil, dass ihr zweiter Schritt aufgrund der Abspaltung von molekularem Stickstoff irreversibel ist und somit das Gleichgewicht auf die Seite der Produktbildung verschiebt. Um die orthogonal adressierbaren Funktionalitäten zu erzeugen, enthielten die synthetisierten Bausteine eine Aminooxy-Einheit jeweilig kombiniert mit einem Tetrazin oder Reppeanhydrid. Diese bifunktionellen Einheiten waren synthetisch leicht zugänglich und wurden in eine Vielzahl von molekularen Konstrukten installiert, ohne deren strukturelle Eigenschaften zu beeinträchtigen. Sukzessive Reaktion über die DARinv resultierte in definierten Konjugaten mit gutem bis quantitativen Umsatz. Die Modularität dieses synthetischen Zweistufenverfahrens bietet den Vorteil, dass sobald die DARinv-Einheit in das Molekül von Interesse installiert wurde, es mit jedem gewünschten Reaktionspartner reagieren kann. Somit ist dieses Verfahren für die Generierung von Peptidkonjugaten, sowohl mit synthetischen als auch rekombinanten Peptiden, anwendbar. Die dritte Studie, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurde, (Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 14842–14846) zielte auf die Ausarbeitung einer synthetischen Strategie für hybride organischanorganische kubisch-oktamerische Silsesquioxan-Derivate und deren Anwendung als Gerüstmolekül für die Generierung eines zellpenetrierenden Transportsystems. In einer vorherigen Studie wurden die zellpenetrierenden Eigenschaften von Ammonium-funktionalisierten COSS-Nanopartikeln und ihre Akkumulation im Nukleoli nachgewiesen. Basierend auf diesen Ergebnissen war der nächste Schritt die Entwicklung von neuen COSS-Partikeln mit positiv geladenen flankierenden Armen und die Untersuchung ihrer zellpenetrierenden Eigenschaften. Der Transport eines therapeutischen Wirkstoffes in lebende Zellen sollte die Funktionsfähigkeit der neuen Generation von molekularen Transportern zeigen. Im Rahmen dieser Studie wurde gezeigt, dass die entwickelten guanidierten COSS-Nanopartikel (GuCOSS) eine viel höhere und schnellere Zellaufnahme zeigten als die üblicherweise verwendeten zellpenetrierenden Peptide (z.B. TAT, Penetratin, Hepta- und Dekaarginine). Diese Effizienz (78-fach höher als bei Heptaarginin, das die gleiche Art und Anzahl von geladenen Gruppen trägt) kann durch die geringe Größe und die dadurch bedingte hohe Ladungsdichte um den COSS-Kern erklärt werden. Interessanterweise zeigten sich unsere neuartigen, zellgängigen Module promiskuitiv hinsichtlich der Zielzellen. Tatsächlich wurde eine effiziente zelluläre Aufnahme in verschiedene Zellarten beobachtet, darunter Gram-negative Bakterien (Escherichia coli), Hefe (Saccharomyces cerevisiae) und Archeen (Sulfolobus islandicus, Sulfolobus tokodaii, Halobacterium salinarum) sowie humane Krebszelllinien. Da die Zellaufnahme bei 4°C im Vergleich zu der bei 37°C nur unwesentlich reduziert war, wurde ein energieunabhängiger Mechanismus vorgeschlagen. Zusätzlich degradiert der COSS-Kern innerhalb der Zelle und für die Einzelkomponenten an sich wurde keine bis niedrige Toxizität vorhergesagt. Diese Erwartung wurde durch die Untersuchung der Zellaufnahme, Toxizität und Degradation des GuCOSSModuls bestätigt. Als Proof-of-Concept Cargo für den intrazellulären Transport wurde der therapeutische Wirkstoff Doxorubicin verwendet, da dieser in freier Form nur sehr langsam durch passive Diffusion in die Zelle permeieren kann. Doxorubicin wurde über eine Disulfidbrücke an den hocheffizient-zellpenetrierenden heptaguanidierten COSS-Nanopartikel konjugiert. Das jeweilige Oktaammonium COSS-Derivat wurde dafür an einer Ecke mit einem Cystein, funktionalisiert. Anschließende Guanidinylierung der verbleibenden Amine, gefolgt von der Bildung einer Disulfidbindung über das Aldrithiol™-2- modifizierte Zytotoxin resultierte in einem hybriden zellpenetrierenden Konjugat an das ein Wirkstoff eine Disulfidbrücke angebunden ist. Die Disulfidbrücke sollte in dem reduzierenden Milieu des Zytoplasmas gespalten werden und das Zytotoxin freigeben. Die durchgeführten Zytotoxizitätsstudien der Hybride zeigten eine erhöhte Toxizität gegenüber dem freien Wirkstoff. Zusätzlich konnte die Inkubationszeit durch die schnelle Zellaufnahme signifikant reduziert werden. Da es viele Wirkstoffe gibt, die nicht zellgängig sind und/oder schlecht wasserlöslich, z.B. Hygromycin, Ispinesib etc. eröffnet der GuCOSS-basierte molekulare Transporter neue Wege für die erleichterte Aufnahme dieser Therapeutika. Zusammengenommen leisten die Ergebnisse dieser kumulativen Forschungsarbeit, im Hinblick auf die Anwendbarkeit, Vielseitigkeit, Zuverlässigkeit und Kompatibilität mit komplexen molekularen Strukturen, unabhängig ihres Ursprungs, einen Beitrag zur Toolbox der modernen, bioorthogonalen Methoden. Darüber hinaus erweitert die Kombination von klassischer Chemie mit modernen, biokompatiblen Ligationsmethoden, darunter beispielsweise Enzym-unterstützte Reaktionen, das Spektrum bioorthogonaler Konjugationsstrategien.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
To date, a vast number of chemical reactions compatible with bioinspired, bioengineered, and biomimetic molecules has been elaborated in response to the demands of the steadily growing repertoire of conjugation techniques. However, the choice of the suitable approach from the toolbox of these so-called bioorthogonal methods still remains case-sensitive. Therefore, the central goal of the presented cumulative work was the design and elaboration of new combined orthogonal bioorthogonal[1] synthetic strategies comprising the combination of certain chemo- and site-selective reactions, and their application to the generation of macromolecular conjugates with tailor-made properties. For each hybrid construct a customized bioorthogonal synthetic strategy was developed, carefully considering the intrinsic properties, special requirements, and distinct constraints of the reaction partners. A vast number of compounds from different molecular classes were investigated, ranging from rather small cytotoxic drugs, oligopeptides and highly ordered cube-octameric silsesquioxanes (COSS) to crystalline nanocellulose and full-size functional proteins. The first study (Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 12618-12623) addressed the development of a site-directed, bioorthogonal and modular approach towards the immobilization of biomolecules on a crystalline nanocellulose (CNC) platform. The ultimate goal was the covalent chemoselective coupling of bioactive proteins to the surface of CNC – a sustainable, nature-derived macromolecular compound. These constructs should combine the properties of the immobilized biomolecules with the intrinsic characteristics of the cellulose nanocrystals, such as low toxicity, water and biocompatibility as well as obvious advantages given by their nanosize. The challenge of this investigation was to circumvent the general drawbacks of commonly used protein conjugation methods, with respect to enhanced selectivity and operability under physiological conditions in aqueous milieu. To that end, a generic two-step procedure was developed that implied a set of solely efficient orthogonal reactions, avoiding the need of organic solvents and compatible with physiological systems. Making use of efficient oxime ligation and subsequent sortase-mediated conjugation, the synthetic strategy exhibited the required regiospecificity and biocompatibility, which favored its application to a vast number of functional proteins. Thus, following TEMPO-mediated oxidation of CNC hydroxyls, first a small fluorophore moiety was immobilized, enabling the detection of aminooxy-addressable surface aldehydes. Subsequently, oximation with the peptidic linker was established leading to sortase-addressable sites on CNC carrier. Afterwards, the enzyme-mediated surface immobilization proceeded using three proteins of different classes, diverse size, complexity and bioactivity under preservation of their biological function. In this work, an engineered Sortase A (eSrtA) variant was used as it exhibited improved catalytic properties. Moreover, it has been demonstrated that the well-defined orientation of the proteinaceous ligands ensured by the site-selective coupling resulted in an enhanced, compared to randomly grafted proteins, bioactivity. Taken these findings into account, it could be concluded that sustainable nanosized biomaterials represent excellent platforms for the customized immobilization of high-profile macromolecules for biomedical purposes, drug delivery or deposition. It might even be interesting to investigate their applicability as platforms for the immobilization of proteins of interest with subsequent application in affinity chromatography. The second study (Chem. Commun., 2015, 51, 11130-11133) was devoted to the development of a synthetic strategy for the ultimate generation of a hybrid organic-inorganic construct comprising one of the smallest known cube-octameric silsesquioxane nanoparticle and a functional peptidic counterpart. Synthesis design, especially considering the choice of an appropriate bioorthogonal method, proceeded from a premise that COSS core is not stable in the presence of nucleophiles. In the proof-of-concept experiments, the applicability of a modular synthetic approach combining generation of an N-terminal peptide aldehyde, efficient oxime ligation and inverse electrondemand Diels-Alder reaction (DARinv) was demonstrated upon conjugation of linear, cystine-cyclized, and multi-disulfide functional peptides of diverse size. Further the strategy was expanded to the synthesis of constructs with more sophisticated architecture. In the scope of this work the DARinv was chosen for the synthesis of the bioconjugates containing peptides of different length, molecular complexity and biological properties due to its reported biocompatibility and fast reaction kinetics.[52] Moreover, this particular reaction has the advantage that its second step is irreversible due to the loss of molecular nitrogen, which shifts the equilibrium towards the product formation.[126] To achieve orthogonally addressable sites, the synthesized building blocks contained an aminooxy moiety in a combination with a tetrazine or Reppe anhydride, respectively. These bifunctional units appeared easy accessible and were installed into a variety of molecular constructs without compromising their structural features. Successive transformation using the DARinv yielded defined conjugates with good to quantitative conversion. The modularity of this synthetic two-step procedure offers the advantage that, once the DARinv moiety has been installed into the molecule of interest, it can react with every desired counterpart. It is feasible for the generation of peptidic conjugates, including synthetic peptides as well as the recombinant ones. The third study discussed in the course of this thesis (Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 14842–14846) was aimed on the elaboration of a synthetic strategy towards hybrid organic-inorganic cube-octameric silsesquioxane derivatives and their application as a scaffold upon construction of a cell-penetrating delivery system. This sophisticated construct should be equipped with a cytotoxic drug releasable upon cellular uptake. The restrictions of COSS template considering its stability issues should be taken into account as well. In the preceding study, the cell-penetrating properties of ammonium-functionalized COSS nanoparticles and their accumulation in the nucleoli have been demonstrated.[109a] Based on these findings, the next step was the engineering of additional COSS particles bearing positively charged flanking arms, and investigation of their cell-penetrating features. The delivery of a therapeutic cargo in the living cell should proof the viability of this new-generation molecular transporter. In the scope of this study it was shown that engineered guanidinylated COSS nanoparticle (GuCOSS) exhibited much higher and faster cellular uptake than the respective commonly used cell-penetrating peptides (e.g. TAT, penetratin, hepta- and decaarginine). This efficacy (78-fold more potent as heptaarginine bearing the same sort and amount of charged groups) can be rationalized taking into consideration the significantly smaller size and, therefore, higher charge density around the COSS core. Interestingly, our novel cell-permeation module appeared rather promiscuous to targeted cells. Indeed, an efficient cellular uptake was observed in different species, among them Gram-negative bacteria (Escherichia coli), yeast (Saccharomyces cerevisiae), and archaea (Sulfolobus islandicus, Sulfolobus tokodaii, Halobacterium salinarum) as well as in human cancer cell lines. As the uptake was only negligibly reduced at 4°C, compared to that at 37°C, an energy-independent mechanism was proposed. Moreover, the COSS core degrades inside the cell and the components themselves are predicted to exhibit non to low toxicity. This expectation was corroborated upon thorough analysis of the cellular uptake, toxicity, and degradation of a GuCOSS module. The therapeutic drug doxorubicin was chosen as proof-of-concept cargo for intracellular delivery as, being applied solely, it can only enter the cell slowly via passive diffusion. Therefore, doxorubicin was conjugated to a highly efficient cell-penetrating heptaguanidinylated COSS nanoparticle. To that end, the respective octaammonium COSS derivative was single-corner equipped with a cysteine. Subsequent guanidinylation of the remaining amines followed by disulfide bond formation with an aldrithiol™-2- modified doxorubicin resulted in a cell-penetrating module carrying a releasable cytotoxic cargo. Indeed, the disulfide bridge breaks in the reducing milieu of the cytoplasm, thus liberating the active drug. The cytotoxicity studies of the hybrids showed an enhanced toxicity of the conjugate compared to the free compound. Moreover, due the fast cellular uptake, the incubation time was significantly reduced. As there are plenty of drugs lacking cell permeation and/or water solubility, e.g. hygromycin, ispinesib etc., the GuCOSS-based molecular transporter can open new avenues towards facilitated cellular uptake of these therapeutics. Taken together, the outcome of this cumulative research contributes to the toolbox of modern bioorthogonal methods in view of applicability, versatility, reliability, and compatibility with complex molecular architectures irrespectively on their natural or manmade origin. Moreover, combination of traditional chemistry with modern biocompatible ligation methods, among them enzyme-assisted transformations, expand the spectrum of bioorthogonal conjugation strategies.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 16 Dec 2016 14:45
Last Modified: 16 Dec 2016 14:45
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-58755
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Neumann, Prof. Dr. Siegfried and Biesalski, Prof. Dr. Markus and Göringer, Prof. Dr. Hans Ulrich
Refereed: 7 November 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5875
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