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Replicons: functional elementary units of genome architecture

Reinhart, Marius Armin :
Replicons: functional elementary units of genome architecture.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2016)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Replicons: functional elementary units of genome architecture
Language: English
Abstract:

Only 750 years after Roger Bacon developed the first simple microscope, super-resolution microscopy is in full swing, letting us go where no one has gone before: beyond the Abbe limit. A perfect dance performance is needed as thousands of replisomes dance around the DNA during the Synthesis-Phase, for even a single error could lead to cell death or cancer. To gain an understanding of the choreography and the complex regulations necessary to maintain this highly dynamic process without a misstep, I employed recent advancements in microscopy. Due to improvements made in the last decade, it is now possible to take a closer look at the individual participants of DNA replication, the replisomes. My aim was to dive into the depth of DNA replication dynamics to detect, analyze and quantify DNA replication on the level of single replication machineries (replisomes). Up until now imaging with high temporal resolution could only be achieved by live cell microscopy, trading spatial resolution against temporal resolution and photobleaching. I laid a solid foundation for my DNA replication studies by refining a cell staining method using "pulse and chase" experiments to gain temporal resolution in single fixed cells. This approach allows the study of highly dynamic DNA synthesis processes with the high spatial resolution achievable in fixed cells. For the statistical evaluation of this multi-label super-resolution data, I designed a computer guided approach to quantify thousands of replication foci in hundred of cells with a minimal amount of operator interaction. This program is a robust tool to quantify DNA replication foci free of observer bias and achieves consistent quantifications during biological and technical replicates. The application of the newly developed foci recognition toolkit enabled me to resolve and quantify DNA replication foci formerly lost in the mist of wide field or even confocal imaging. The DNA replication foci quantification matched beautifully with the calculated numbers by Mills et al. and Hozák et al., indicating the ability to finally resolve DNA replication on the replisome level. This was further confirmed by DNA fiber measurements of DNA replication fork speed (RFS), inter origin distances (IODs), genome size analysis and DNA replication (S-Phase) timing. To dig even deeper into the highly dynamic DNA replication processes, a simplistic computer model was created to simulate DNA synthesis in silico. Using the aquired biological data, I was able to correlate simulated in silico microscopy images from this 1D replication model to live cell microscopy in 4D. Altogether I was able to answer basic questions regarding the control of DNA replication on the level of individual replisomes. I resolved and quantified individual replisomes and utilized those measurements to cogenerate a theoretical DNA replication simulation model.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Vor 750 Jahren entwickelte Roger Bacon das erste Mikroskop. Heute stehen uns ultrahochauflösende Mikroskope zur Verfügung, die es uns ermöglichen in Welten vorzudringen die nie ein Mensch zuvor gesehen hat. Die technische En- twicklung der Mikroskope erlaubt es die hochgradig dynamischen und komplexen Prozesse der DNA Replikation im Detail zu untersuchen. Alle partizipierenden DNA Replikationsproteine befinden sich in einem stetigen Tanz um die zu verdoppelnde DNA, sie formen Replikationsmaschinen, lesen und verdoppeln das Genom, um im Anschluss zerlegt, abgelöst und an einer neuen Sequenz wieder aufgebaut zu werden. Diese Choreographie muss genauestens reguliert und überwacht werden, da bereits der kleinste Fehler weitreichende Konsequenzen haben kann. Mein Ziel war es, durch die Beobachtung einzelner Replisome (DNA Replikationsmachinen) einen neuen, tieferen Einblick in die Prozesse der DNA Replikation zu erhalten. Bis jetzt konnten zeitliche und zeitlich-räumliche Abläufe in Zellen nur durch Lebendzellmikroskopie untersucht wer- den, dabei musste man aber auf die überlegene Auflösung von ultrahochauflösenden Mikroskopen verzichten, da deren exzessives Lichtbedürfnis zum Bleichen der eingesetzten Fluorophore bis hin zum Zelltod durch Phototoxizität geführt hätte. Das von mir entwickelte Verfahren erlaubt es vier aufeinanderfolgende Zeitpunkte in einer Zelle zu markieren, diese im Anschluss mit ultrahochauflösender Mikroskopie zu untersuchen und den zeitlichen Ablauf sichtbar zu machen. Dieser Ansatz ermöglicht es, in fixierten Zellen einen Einblick in den hochdynamischen Prozess der DNA Replikation zu erhalten. Der Auflösungsgewinn durch ultrahochauflösende Mikroskope geht Hand in Hand mit einem Anwachsen der Rohdaten. Zur beobachterunabhängigen Auswertung dieser Daten habe ich ein computergestütztes Programm entwickelt, dass aufgrund der intrinsischen Bilddaten wichtige Parameter für sensible Variablen der Auswertung vorgibt. Die praktis- che Anwendung beider Methoden ermöglichte es mir DNA Replikationsorte in mehreren hundert Zellen zu messen, zu separieren und zu zählen. DNA Stranganalysen zur DNA Replikationsgeschwindigkeitsmessung sowie der Distanz zwischen aktivierten DNA Replikationsstartpunkten und die Bestimmung der Genomgröße bestätigen diese Theorie. Die Messungen zu den biologischen Grundlagen der Replikation wurden anschließend genutzt um ein DNA Replikationscom- putermodell zu erzeugen. Dieses Modell versetzt uns zum ersten Mal in die Lage, simulierte 1D Replikationsfortschritte und die Aktivierung neuer DNA Replikationsstartpunkte mit ultrahochauflösenden Mikroskopiebildern zu vergleichen. Diese Arbeit ermöglichte es mir grundlegende Fragen der DNA Replikation zu beantworten, und diese bis hinunter auf das Replisomelevel zu verfolgen.German
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: DNA Replication, replicon, replisome, simulation, super resolution, microscopy, domino
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Cell Biology and Epigenetics
Date Deposited: 19 Dec 2016 13:17
Last Modified: 19 Dec 2016 13:17
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-58660
Referees: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina and Drossel, Prof. Dr. Barbara
Refereed: 24 November 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5866
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