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Use of S-sulfocysteine (SSC) as a L-cysteine source in Chinese hamster ovary (CHO) suspension batch and fed-batch cultures

Hecklau, Caroline :
Use of S-sulfocysteine (SSC) as a L-cysteine source in Chinese hamster ovary (CHO) suspension batch and fed-batch cultures.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2016)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Use of S-sulfocysteine (SSC) as a L-cysteine source in Chinese hamster ovary (CHO) suspension batch and fed-batch cultures
Language: English
Abstract:

Numerous proteins being used as therapeutic agents such as therapeutic antibodies are produced within cell cultures. This work sought to develop a single nutrient solution (single feed) for fed-batch processes comprising all nutrients in one complex feed at neutral pH without impacting or improving cell culture performance, titer and monoclonal antibody (mAb) characteristics. The amino acid L-cysteine was shown to rapidly dimerise into poorly soluble L-cystine via oxidation mechanisms. Addition of L-cysteine to a complex, chemically defined, highly concentrated neutral pH nutrient solution (feed) resulted in rapid production of L-cystine from L-cysteine indicating poor stability of L-cysteine in the feed. To keep L-cysteine stable in the standard fed-batch process at Merck, the amino acid was maintained in an alkaline pH environment separated from the other feed nutrients (two feed strategy). The addition of the alkaline L-cysteine nutrient solution to fed-batch cultures resulted in pH peaks while feedings. To achieve the aim of establishing the single feed strategy, screening of several L-cysteine derivatives was carried out in the part 5.1 of this work. Out of several L-cysteine derivatives, the derivative S-sulfocysteine (SSC) was chosen since it showed the desired physico-chemical properties. In part 5.3 of this work, SSC was shown to be stable over three months at 4°C in chemically defined, complex, highly concentrated neutral pH feed. In part 5.5 of this work, L-cysteine was replaced by SSC in batch cultures with Chinese hamster ovary (CHO) suspension clone 1. It was shown that SSC was able to replace L-cysteine in batch mode indicating that SSC was used as a L-cysteine source. The use of SSC in fed-batch experiments (spin tubes, bioreactors) with CHO suspension clone 2 was examined in parts 5.6 and 5.7. Application of 15 mM SSC (single feed strategy) revealed prolonged growth and increased titer compared with the standard process (two feed strategy). The antibody produced with 15 mM SSC showed no differences in N-glycosylation, charge variant and mAb sequence compared with antibody produced from the standard process as shown in part 5.8. The mechanism of SSC use as a L-cysteine source was described in part 5.9. Due to its interaction with glutathione (GSH), mixed disulfides were generated. After their enzymatic reduction, L-cysteine was released and ready for metabolization. Further, increased intracellular total GSH pools, superoxide dismutase 1 and 2 (SOD-1, SOD-2) levels and decreased intracellular reactive oxygen species (ROS) concentrations were observed in the single-feed containing 15 mM SSC compared with the standard process indicating anti-oxidant related mechanisms of SSC. Toxic effects of 20 mM SSC in fed-batch and 1.5 mM SSC in batch mode on cell growth were correlated to the external pH in part 5.10. The observed drops in pH with toxic SSC concentrations were assumed to be responsible for the monitored reproducible, rapid cell death in batch and fed-batch cultures compared with the standard processes. Further, it was shown that different CHO suspension clones reacted differently to the derivative indicating clone dependent effects of SSC. Overall, the results of this work confirmed the concept of the single-feed strategy in CHO suspension fed-batch culture. For the first time, SSC was successfully used as a L-cysteine source in cell culture. The successful application of SSC in cell culture was shown to be dependent on its applied concentration, the used cultivation mode and clone.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Zahlreiche Proteine, die als therapeutische Wirkstoffe zum Einsatz kommen, wie z.B. therapeutische Antikörper, werden aus Zellkulturen gewonnen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung einer komplexen, chemisch definierten, hoch konzentrierten pH neutralen Nährlösung (Feed) für die Zellkultur, die alle Nährstoffe für Fed-Batch Prozesse beinhaltet (Ein-Feed-Strategie). Dabei sollen das Zellwachstum, die Antikörperproduktion und die Charakteristika des produzierten monoklonalen Antikörpers im Vergleich zum Standard Fed-Batch Prozess nicht verändert oder sogar verbessert werden. Es ist bekannt, dass die Aminosäure L-Cystein schnell zu schwer löslichem L-Cystin durch Oxidationsvorgänge dimerisiert. Die Zugabe von L-Cystein zu einer komplexen, chemisch definierten, hoch konzentrierten pH neutralen Nährlösung (Feed) führt zur schnellen Bildung von L-Cystin. Dies zeigt die geringe Stabilität von L-Cystein im pH neutralen Feed. L-Cystein wird daher in einem separaten, alkalischen Feed im Standard Fed-Batch Prozess der Firma Merck stabil gehalten (Zwei-Feed-Strategie). Durch die Zugabe des alkalischen L-Cystein-Feeds während der Fütterungen ergaben sich pH Spitzen in den Fed-Batch Kulturen. Um das Ziel der Etablierung einer Ein-Feed-Strategie zu realisieren, wurden zunächst verschiedene L-Cysteinderivate getestet wie in Teil 5.1 dieser Arbeit beschrieben. Aus den getesteten L-Cysteinderivaten wurde S-Sulfocystein für weitere Tests ausgewählt, da dieses Molekül die gewünschten physikochemischen Eigenschaften besitzt. In Teil 5.3 dieser Arbeit wird gezeigt, dass S-Sulfocystein über drei Monate bei 4°C in der komplexen, chemisch definierten, hoch konzentrierten pH neutralen Nährlösung stabil ist. In Teil 5.5 dieser Arbeit wird L-Cystein durch S-Sulfocystein in Batch Kulturen mit dem CHO Suspensionsklon 1 ersetzt. In diesen Experimenten zeigte sich, dass S-Sulfocystein L-Cystein ersetzen konnte. Dies deutet darauf hin, dass S-Sulfocystein als Cysteinquelle von diesem Klon genutzt werden konnte. Der Einsatz von S-Sulfocystein in Fed-Batch Experimenten (spin tubes, Bioreaktoren) mit CHO Suspensionsklon 2 wurde in den Teilen 5.6 und 5.7 dieser Arbeit untersucht. Bei Verwendung von 15 mM S-Sulfocystein (Ein-Feed-Strategie) zeigte sich verlängertes Zellwachstum und erhöhter Titer im Vergleich zu dem Standard Fed-Batch Prozess (Zwei-Feed-Strategie). Der in dieser S-Sulfocystein-Kondition produzierte monoklonale Antikörper zeigte keine Unterschiede hinsichtlich N-Glykosylierung, charge variant und Sequenz im Vergleich zum Antikörper aus dem Standard Fed-Batch Prozess wie in Teil 5.8 dieser Arbeit gezeigt. Der Mechanismus zur Wirkung von S-Sulfocystein als L-Cysteinquelle wurde in Teil 5.9 dieser Arbeit untersucht. Durch die Interaktion von S-Sulfocystein mit Glutathion bildeten sich gemischte Disulfide,die S-Sulfocystein als Cysteinquelle nach ihrer enzymatischen Reduktion bereitstellen. Weiterhin wurden im Vergleich zu dem Standard Fed-Batch Prozess (Zwei-Feed-Strategie) erhöhte intrazelluläre Glutathionpools, erhöhte Superoxid Dismutase 1 und 2 Levels und verminderte, intrazelluläre, reaktive Sauerstoffspezies in der Ein-Feed-Kondition mit 15 mM S-Sulfocystein beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass Mechanismen, ähnlich zur Antioxidanz, in der Kondition mit 15 mM S-Sulfocystein bestehen. Toxische Effekte auf das Zellwachstum von CHO Suspensionsklon 2 wurden im Fed-Batch Prozess mit 20 mM S-Sulfocystein und im Batch Modus mit 1.5 mM S-Sulfocystein beobachtet. Die beobachtete Toxizität in beiden Konditionen wird einem extrazellulären pH Abfall zugeschrieben wie in Teil 5.10 dieser Arbeit gezeigt. Es wird vermutet, dass die beobachteten pH Abfälle in toxischen S-Sulfocysteinkonzentrationen für den beobachteten schnellen Zelltod in beiden Prozessformen im Vergleich zu den Standardprozessen verantwortlich sind. Weiterhin wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass verschiedene CHO Suspensionsklone unterschiedlich auf das Cysteinderivat reagieren. Dies deutet darauf hin, dass klonabhängige Effekte bei S-Sulfocystein Verwendung auftreten. Die Ergbenisse dieser Arbeit bestätigen das Konzept der Ein-Feed-Strategie in Fed-Batch Prozessen mit CHO Suspensionszellen. Zum ersten Mal wurde S-Sulfocystein erfolgreich als Cysteinquelle in der Zellkultur eingesetzt. Der Erfolg der S-Sulfocysteinanwendung hängt maßgeblich von der eingesetzten S-Sulfocysteinkonzentration, vom Prozesss und von dem verwendeten CHO Suspensionsklon ab.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
Date Deposited: 14 Dec 2016 08:28
Last Modified: 14 Dec 2016 08:28
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-58611
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and von Hagen, Prof. Dr. Jörg
Refereed: 17 October 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5861
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