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Spezifische Elektrolyteffekte in der Chromatographie von Biopharmazeutika

Vajda, Judith :
Spezifische Elektrolyteffekte in der Chromatographie von Biopharmazeutika.
Technische Universität Darmstadt, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2016)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Spezifische Elektrolyteffekte in der Chromatographie von Biopharmazeutika
Language: German
Abstract:

Biopharmazeutika repräsentieren eine wachsende Gruppe von Arzneistoffen. Ihre Strukturen sind im Vergleich zu klassischen Pharmazeutika komplexer. Um die Verfügbarkeit von Biopharmazeutika für die Masse der Bevölkerung zu gewährleisten, sind kostengünstige, flexibel skalierbare Herstellungsverfahren unabdingbar. Die Produktion von Biopharmazeutika in Zellkultur leistet einen großen Beitrag hierzu, schafft jedoch auch neue Voraussetzungen für darauf die folgenden Aufreinigungsverfahren. Die Biochromatographie ist fester Bestandteil vieler Aufreinigungsverfahren. Während für die mAb Aufreinigung Chromatographie-Plattformen etabliert sind, stellt die Aufreinigung von Viruspartikeln aus Zellkultur eine neue Herausforderung dar. Das Spektrum der Kontaminanten in Zellkultur unterscheidet sich von dem in Eiern produziertem Virusmaterial. Die flüssige Phase in der Biochromatographie birgt dabei ein häufig vernachlässigtes Potential für die Optimierung von Plattformprozessen zur mAb- oder Viruspartikelaufreinigung. Hydrophobe Wechselwirkungen können durch verschiedene Salze und Dualsalze moduliert werden. Sie spielen in der hydrophoben Interaktionschromatographie, der ‚Mixed Mode‘ Chromatographie mit hydrophoben Kationenaustauschern und der Affinitätschromatographie eine Rolle. Die Kapazität für mAbs kann durch Optimierung des Adsorptionspuffers für alle genannten Modi um mindestens 30 % gesteigert werden. Ökonomisch am bedeutsamsten dürfte die Erhöhung der Bindekapazität eines hexameren Protein A Liganden um 100 % für einen mAb sein. Neben der Kapazität beeinflussen Elektrolyte die Selektivität in der Biochromatographie. Ein Gemisch aus Natriumchlorid und Natriumcitrat ermöglicht die Auflösung eines speziellen mAb-Monomers von seinen Aggregaten und weniger hydroben Isoformen auf einer Butyl-Säule, was in einem Standard Ammoniumsulfat-Gradienten nicht realisiert werden kann. Insbesondere die Verwendung von Dualsalzen steigert den erforderlichen Prozessentwicklungsaufwand. Miniaturisierte Parallelchromatographie erlaubt das deutlich schnellere Sichten eines großen Versuchsraumes bei vergleichsweise geringem Probenverbrauch. Dies ermöglicht eine umfassende und frühzeitige Methodenentwicklung. Ein weiterer Engpass in der Methodenentwicklung ist die begleitende Analytik, insbesondere in Hinblick auf Vakzine. Die Freigabe von Vakzinen basiert häufig auf Aktivitätstests. Der Hemagglutinations-Test ist weit verbreitet zur Analyse von Influenzavakzinen. Er beruht auf der Agglutination von roten Blutzellen und Viruspartikeln. Die Massekonzentration des Virus wird aus dem dazu erforderlichen, geschätzten Verhältnis von Erythrozyten zu Viruspartikeln berechnet. Der Test ist mit großen Standardabweichungen (bis zu einer log-Stufe) sowie hohem Arbeits- und Zeitaufwand verbunden. Im Rahmen dieser Dissertation wird das Potential untersucht, analytische Größenausschlusschromatographie als zusätzliche oder substituierende Analytik für Viruspartikel einzusetzen. Die Methode wird mit dem pandemischen Influenza A H1N1v 5258 Impfstamm, sowie den beiden Laborstämmen H1N1 Puerto Rico/8/34 und H3N2 Aichi/2/68 evaluiert. H1N1v 5258 wird im industriellen Maßstab in Zellkultur vermehrt. Die Proben der Laborstämme sind aufgereinigt und stammen aus embryonierten Hühnereiern. Reproduzierbare und hinreichend vollständige Wiederfindungsraten werden für 100 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7.0 mit Zusatz von 200 mM Natriumchlorid erzielt. Die Retention aller Virusproben stimmt überein, was die Universalität der Methode bestätigt. Die Hemagglutinations-Analyse aller Fraktionen der analytischen Größenausschlusschromatographie ergibt, dass ungefähr 50 % der Virusaktivität durch Virusfragmente verursacht wird. Dies bedeutet, dass die gängige Massekonzentrationsberechnung falsch positive Ergebnisse erzielt. Analytische Größenausschlusschromatographie als ergänzende Analytik in Forschung, Entwicklung und Qualitätskontrolle erscheint daher empfehlenswert. In der Prozessentwicklung ermöglicht die gezeigte Methode zur analytischen Größenausschlusschromatographie die Quantifizierung ganzer Viruspartikel in 20 Minuten. Entgegen bisheriger Annahmen sind vergleichsweise hohe Flussraten in der Größenausschlusschromatographie von Influenzaviruspartikeln förderlich. Niedrige Flüsse und lange Verweilzeiten beeinflussen die Polydispersität der Viruspartikel Proben. Die Stabilität der Viruspartikel wird auch durch verschiedene Elektrolyte beeinflusst. Natriumphosphat erweist sich als wirkungsvoll, insbesondere während der Anionenaustauschchromatographie mit einem Polyamin-Liganden. Die Kapazität des Polyamin-Anionenaustauschers ist je nach Pufferbedingungen bis zu 6,4-mal höher als für ein Harz mit immobilisiertem, quaternärem Ammonium-Liganden. Natriumphosphat-Puffer wirkt sich positiv auf die Bindekapazitäten beider Harze für Viruspartikel aus, was dem Verhalten von Proteinen widerspricht. Möglicherweise beruht diese Kapazitätserhöhung auf einem Pseudoaffinitätsmechanismus des Polyamin-Liganden mit dem viralen Protonenkanal M2. Um eine Wiederfindung des Viruspartikels vom Polyamin-Adsorber zu erzielen, ist die Verwendung von Natriumphosphat-Puffer gegenüber Tris/HCl-Puffer und Natriumchlorid zur Elution vorteilhaft. Andere polyvalente Anionen wie Citrat wirken sich ebenfalls positiv auf die Wiederfindung der Viruspartikel aus. Polyvalente Anionen beeinflussen die erzielte DNA-Abreicherung jedoch nachteilig. Die durch polyvalente Ionen verursachten Effekte hinsichtlich der Anionenaustauschchromatographie von Influenzaviruspartikeln beruhen wahrscheinlich auf der höheren Avidität, der vergleichsweise höheren eingetragenen Ionenstärke und der Quervernetzung der Polyamin-Liganden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Biopharmaceuticals represent a growing class of drug substances. Their structures are more complex in comparison to classical pharmaceuticals. Cost-effective and flexibly scalable production processes are indispensable to ensure availability for a majority of the population. Production of biopharmaceuticals in cell culture contributes immensely to this. However, it also creates new conditions for the subsequent purification processes. Biochromatography is an inherent component of many downstream processes. While chromatography platforms for mAb purification are well established, purification of virus particles from cell culture represents a new challenge. The cell culture derived contaminant spectrum differs from egg produced virus material. The liquid phase in biochromatography holds a frequently neglected potential in optimization of platform processes for mAb and virus particle purification. Hydrophobic interactions can be modulated by different salts and dual salt mixtures. They play a role in hydrophobic interaction chromatography, mixed mode chromatography with hydrophobic cation exchangers, and affinity chromatography. Capacity of all mentioned modes for mAb can be increased by at least 30 %, optimizing the adsorption buffer. The increase of binding capacity of a hexameric protein A ligand for a mAb by 100 % might be the economically most significant achievement. Besides capacity, different electrolytes affect selectivity of biochromatography. A mixture of sodium chloride and sodium citrate allows for resolution of a particular mAb monomer from its aggregates and less hydrophobic isoforms on a butyl column, which cannot be realized in a standard ammonium sulfate gradient. Especially, the use of dual salts increases the efforts required in process development. Miniaturized parallel chromatography enables significantly faster screening of a large design space at comparatively low sample consumption. This facilitates a comprehensive and early method development. Another bottleneck in method development is the accompanying analytics, in particular regarding vaccines. Release of vaccines is frequently based on activity assays. The hemagglutination assay is widely applied for the analysis of influenza vaccines. It is based on agglutination of red blood cells with virus particles. The mass concentration of viruses is calculated using therefore required, estimated ratio of erythrocytes to virus particles. The assay is afflicted with high standard deviations (up to one order of magnitude), and excessive work and time. In the context of this thesis, the potential of analytical size exclusion chromatography as an additional or substituting analysis has been investigated for virus particles. The method is evaluated with the pandemic influenza A H1N1v 5258 vaccine strain, as well as with the two lab strains H1N1 Puerto Rico/8/34 and H3N2 Aichi/2/68. H1N1 5258 is propagated in cell culture on industrial scale. Samples of the two laboratory strains originate from embryonated chicken eggs and are purified. Reproducible and sufficiently complete recoveries are achieved in 100 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0 with addition of 200 mM sodium chloride. Retention of all virus samples coincides, which confirms the universality of the method. Hemagglutination analysis of all fractions from size exclusion chromatography indicates that roughly 50 % of the virus activity is based on virus fragments. This means that the commonly applied mass concentration calculation leads to false positive results. Hence, analytical size exclusion chromatography seems advisable as a complementary analysis in research, development, and quality control. The presented analytical size exclusion chromatography method provides quantification of whole virus particles in process development within 20 minutes. In contrast to previous assumptions, comparatively high flow rates in size exclusion chromatography of influenza virus particles are beneficial. Low flow rates and extended residence times affect the polydispersity of the virus particle samples. Stability of virus particles is further impacted by several electrolytes. Sodium phosphate proofs to be efficient, particularly during anion exchange chromatography with a polyamine ligand. Capacity of the polyamine anion exchanger is up to 6.4 times higher, compared to a resin with an immobilized quaternary ammonium ligand and depending on the conditions. Sodium phosphate buffer supports binding capacity of both resins for virus particles, which contradicts the behavior of proteins. This might be due to a pseudo affinity mechanism, involving the polyamine ligand and the viral proton channel M2. Sodium phosphate buffer is beneficial for achieving virus recovery from the polyamine adsorber, compared to Tris/HCl buffer and sodium chloride for elution. Other polyvalent anions, such as citrate, improve virus particle recovery, as well. However, polyvalent anions adversely influence DNA removal. Effects of polyvalent ions regarding anion exchange chromatography of influenza virus particles are probably due to a higher avidity, a comparatively greater contribution to ionic strength, and cross-linking of the polyamine ligand.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 24 Nov 2016 15:02
Last Modified: 24 Nov 2016 15:06
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-57802
Referees: Müller, Priv. Doz. Egbert and Hubbuch, Prof. Dr. Jürgen
Refereed: 17 October 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5780
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