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Kontrolle des prä-mRNA Spleißens durch synthetische Riboswitche

Groher, Florian :
Kontrolle des prä-mRNA Spleißens durch synthetische Riboswitche.
Technische Universität Darmstadt, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2016)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Kontrolle des prä-mRNA Spleißens durch synthetische Riboswitche
Language: German
Abstract:

RNA-Aptamere sind Moleküle, die über in vitro-Selektion aus einer randomisierten RNA-Bibliothek gewonnen werden und ihre Zielmoleküle mit hoher Affinität und Spezifität binden. In dieser Arbeit wurde die Möglichkeit untersucht, eine für Protein-Selektionen etablierte Methode auf niedermolekulare Substanzen zu übertragen. Zur Etablierung der Selektionsmethode, die auf Streptavidin-beschichteten, paramagnetischen beads beruhte, wurde das Fluorchinolon Ciprofloxacin als Zielmolekül verwendet. Das pharmakologisch gut untersuchte Ciprofloxacin wies eine niedrige Zytotoxizität und eine hohe Zellgängigkeit auf, was für die spätere in vivo-Applikation wichtige Eigenschaften darstellte. Die Selektion gegen Ciprofloxacin führte zu einer spezifischen Anreicherung von Aptameren. Der Großteil der angereicherten Sequenzen enthielt eine Stamm-Schleifenstruktur mit einem ausgebulgten Guanin benachbart zu einem G-U Wobble-Paar im Stamm und dem Sequenzmotiv GCAGGA in der terminalen Schleife. Die nähere Charakterisierung zeigte jedoch, dass die Aptamere nicht den freien Liganden alleine erkennen, sondern die Selektionsmatrix in die Bindung involviert ist. Eine Visualisierung des immobilisierten Ciprofloxacins an Streptavidin zeigte, dass sich der Ligand für eine erfolgreiche Selektion wahrscheinlich nicht genug von der Streptavidinmatrix abhebt und sich somit diese Selektionsmethode nicht für niedermolekulare Substanzen eignet. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das TetR-bindende Aptamer verwendet, um Intronretention zu kontrollieren. Das TetR-Aptamer wurde in die Nähe der 5’-Spleißstelle eines chimären Introns platziert und durch Überexpression von TetR wurde die Zugänglichkeit des Spleißosoms zur Spleißstelle reduziert. Durch Zugabe von Doxycyclin konnte die TetR-TetR- Aptamer-Interaktion unterbrochen und so die 5’-Spleißstelle wieder zugänglich gemacht werden. Dies führte auf Reportergen-Ebene zu einem Regulationsfaktor von 12,6-fach. Durch die systematische Untersuchung von Intronposition, relative Aptamerposition sowie Stammlänge und -stabilität des Aptamers wurden Regeln für die Anwendbarkeit des Systems aufgestellt. Der Einfluss der Sequenzumgebung lies den Schluss zu, dass die 5’-Speißstelle 2 bzw. 4 nt einzelsträngig vorliegen muss, damit es zur Konkurrenzsituation zwischen Spleißosom und TetR kommen kann. Die mittlere Stammstabilität wurde auf -15,0 kcal/mol berechnet und die relative Aptamerposition sollte bei 6 bzw. 7 nt nach der 5’-Spleißstelle liegen. Im Kontext des verwendeten chimären Introns konnte der durch Doxycyclin erhaltene Phänotyp (AN-Schalter) durch Variation des Abstands zur 5’-Spleißstelle umgekehrt werden (AUS-schalter). Darüber hinaus wurde in dieser Studie das TetR-Protein durch Anfügen einer N-terminalen Kernlokalisationssequenz für die Spleißregulation optimiert. Die Übertragbarkeit dieses synthetischen Riboregulators wurde durch Anwendung auf die Gene CD20 und HSV- TK gezeigt. Durch Kontrolle dieser Gene konnte die Induktion der Apoptose kontrolliert und die Zellviabilität von Hek-293-Zellen um den Faktor 3,5x beeinflusst werden. Die hohe Modularität des Systems, die einfache Verwendung des Riboregulators in prinzipiell jedem Gen ohne weiteres Re-Design des Regulators selbst und die hohe Affinität und Reversibilität der Schaltung machen dieses System basierend auf der Kontrolle der Intronretention zum idealen Baustein, um synthetisch konstruierte Schaltkreise zu kontrollieren. Zudem kann dieses System genutzt werden, um die Grundlagen von Intronretention in Zukunft näher zu verstehen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
RNA aptamers are molecules which are obtained through an in vitro selection process from a randomized RNA library. RNA aptamers are able to bind their target molecules with high affinity and specificity. In this work, the possibility was investigated to transfer an established for protein selections only method to low molecular weight substances. To establish the selection method, the fluoroquinolone ciprofloxacin was immobilized on paramagnetic beads. The pharmacologically well-studied ciprofloxacin shows low cytotoxicity and high cell permeability, which is necessary for the subsequent in vivo applications. The selection against ciprofloxacin led to a specific enrichment of aptamers. The majority of enriched sequences contained a stem-loop structure with a bulged guanine adjacent to a G-U wobble pair in the stem and the sequence motif GCAGGA in the terminal loop. The detailed characterization, however, showed that the aptamers not only detect the ligand alone, but also the selection matrix is involved into binding. In the second part of this work the TetR binding aptamer was used to control intron retention. The TetR-aptamer was placed in close vicinity of the 5’ splice site of a chimeric intron and by overexpression of TetR protein the accessibility of the spliceosome to splice has been reduced. Through addition of doxycycline TetR-tetR-aptamer-interaction was interrupted and so the 5’ splice site was set free. This led to regulatory factors of 12.6-fold. Moreover, in this study, the TetR protein has been optimized by adding a N-terminal nuclear localization sequence for splice regulation. The portability of this synthetic riboregulator was demonstrated by introducing them to the CD20 and HSV TK genes. By controlling these genes, it was possible to change the induction of apoptosis and cell viability in Hek-293 cells.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 29 Sep 2016 09:59
Last Modified: 29 Sep 2016 09:59
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-56642
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich
Refereed: 13 April 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5664
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