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Investigation of factors involved in late stages of homologous recombination

Waizenegger, Anja :
Investigation of factors involved in late stages of homologous recombination.
Technische Universität Darmstadt, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2016)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Investigation of factors involved in late stages of homologous recombination
Language: English
Abstract:

Homologous recombination (HR) is an important mechanism to maintain genomic stability, as it is involved in the repair of double-strand breaks (DSBs) and the stabilization of replication forks. To initiate HR, the DNA ends at the break site are resected, generating single-stranded DNA (ssDNA) which is then covered by Rad51 molecules and represents the nucleoprotein filament. During a process called synapsis, this nucleoprotein filament performs homology search and strand invasion within the undamaged sister chromatid. To allow recombination-associated DNA synthesis, using the homologous DNA sequence as a template for repair, Rad51 molecules need to be removed from the DNA. This removal is promoted by the motor protein Rad54, which actively translocates along the heteroduplex DNA and permits subsequent binding of the polymerase to finalize HR. The enzymatic steps and proteins involved in early HR are well established, but later steps of recombination are yet less defined. In this study two new factors, Nek1 and ATRX, were identified which are involved in these late steps of HR, thereby contributing to a better understanding of this important repair pathway. In the publication “Nek1 Regulates Rad54 to Orchestrate Homologous Recombination and Replication Fork Stability”, the never in mitosis A related kinase 1 (Nek1) was shown to regulate the function of Rad54 by phosphorylation at serine 572. This phosphorylation allows removal of Rad51 in late G2 phase, which is necessary to proceed with subsequent HR steps. In S phase however, Rad54 is not phosphorylated and thereby not enabled to remove Rad51 from replication forks, as Rad51 functions in the protection of stalled replication forks from nucleolytic degradation. Nek1 depletion or expression of an unphosphorylatable form of Rad54 (Rad54-S572A) resulted in a G2-specific HR repair defect due to persisting Rad51 molecules on the DNA. In contrast, expression of a phosphomimic form of Rad54 (Rad54-S572E) did not impair HR in G2, but promoted undesired removal of Rad51 from stalled replication forks in S phase. Therefore, Nek1 is a crucial factor for the regulation of Rad54 during the cell cycle, contributing to replication fork stability in S phase and HR functionality in G2 phase. Another novel HR factor was identified in the manuscript “Involvement of ATRX in Homologous Recombination Repair”. Alpha-thalassemia mental retardation X-linked protein (ATRX) was shown here to function during post-synaptic steps of HR. Depletion of ATRX resulted in reduced HR-frequencies in reporter assays, increased numbers of unrepaired DSBs in G2 at late times after irradiation (IR), and the absence of IR-induced sister chromatin exchanges (SCEs). The formation of Rad51 foci as a readout for ongoing HR repair was not affected in ATRX depleted cells compared to control cells and also the removal at late times was almost normal. This indicated an involvement of ATRX downstream of Rad54-dependent Rad51 removal. Furthermore we could show that ATRX interacts with the DNA clamp protein PCNA (proliferating cell nuclear antigen), which is known to be involved in the subsequent step of DNA-synthesis. Strikingly, we identified a PIP box within the ATRX amino acid sequence, which potentially mediates the interaction with PCNA. Therefore, we discovered a function for ATRX besides its established role during replication in S phase and could establish, that ATRX functions in G2-phase during HR, where it interacts with PCNA.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die Homologe Rekombination (HR) ist ein wichtiger Prozess für den Erhalt der genomischen Integrität, da dieser sowohl für die Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) als auch die Stabilisierung von arretierten Replikationsgabeln essentiell ist. Zu Beginn der HR werden die DSB Enden resektiert, wobei einzelsträngige DNA (ssDNA) entsteht, die anschließend von Rad51 gebunden wird und das sogenannte Nukleoproteinfilament bildet. Dieses Filament ist essentiell für den Vorgang der Homologiesuche im Schwesterchromatid, was letztendlich zur Stranginvasion führt. Um nachfolgend die DNA-Reparatursynthese einzuleiten, wobei die homologe, unbeschädigte Sequenz als Vorlage für die Reparatur verwendet wird, muss Rad51 zunächst von der DNA entfernt werden. Diese Aufgabe erfüllt das Motorprotein Rad54, indem es aktiv auf der DNA transloziert und Rad51 Moleküle ablöst. Dadurch kann im nächsten Schritt die Rekrutierung der DNA-Polymerase und somit die DNA-Synthese eingeleitet werden. Während die frühen Schritte der HR und die dabei involvierten Proteine bereits gut erforscht sind, sind die späten Schritte bislang weniger gut verstanden. Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei neue Faktoren identifiziert, die bei den späten Schritten der HR jeweils eine wichtige Rolle spielen und somit zu einem besseren Verständnis dieses Reparaturweges beitragen. In der Veröffentlichung “Nek1 Regulates Rad54 to Orchestrate Homologous Recombination and Replication Fork Stability” konnte gezeigt werden, dass die Kinase Nek1 (Never-in-mitosis A related protein kinase 1) die Funktion von Rad54 reguliert, indem diese Rad54 am Serin 572 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung ermöglicht das Entfernen von Rad51 in der späten G2-Phase, was notwendig ist, um die nachfolgenden Schritte der HR einzuleiten. Während der S-Phase hingegen liegt Rad54 stets unphosphoryliert vor, was ein Entfernen von Rad51 von den Replikationsgabeln verhindert und somit gewährleistet dass Rad51 arretierte Replikationsgabeln vor Degradierung durch Nukleasen schützt. Die Depletion von Nek1 sowie die Expression der nicht-phosphorylierbaren Form von Rad54 (Rad54-S572A) resultierten in einem G2-Phase spezifischen HR-Reparaturdefekt, da Rad51-Moleküle unter diesen Umständen an der DNA persistieren. Die Expression einer dauer-phosphorylierten Form von Rad54 (Rad54-S572E) hingegen führte zu keiner Beeinträchtigung der HR in der G2-Phase, allerdings konnte in diesen Zellen ein unerwünschtes Entfernen von Rad51 an arretierten Replikationsgabeln und eine damit verbundene Degradierung während der S-Phase festgestellt werden. Nek1 ist somit ein wichtiger Faktor um die Aktivität von Rad54 zu regulieren, wodurch zum einen bei Replikationsstress die Replikationsgabeln in der S-Phase geschützt werden und zum anderen die HR-Reparatur während der G2-Phase effizient ablaufen kann. Ein weiterer neuer HR-Faktor wurde im Manuskript “Involvement of ATRX in Homologous Recombination Repair” identifiziert. Es konnte hierbei gezeigt werden, dass ATRX (Alpha-Thalassemia mental Retardation X-linked) in post-synaptische Schritte der HR involviert ist. Die Depletion von ATRX führte zu einer verringerten HR-Frequenz in Reporter-Assays, einer erhöhten Anzahl unreparierter DSBs in G2 zu späten Zeiten nach Bestrahlung (IR) und dem Ausbleiben IR-induzierter Schwesterchromatid-Austausche (SCEs). In diesen Zellen war die Ausbildung von Rad51-Foci vergleichbar mit Kontrollzellen und auch das Entfernen von Rad51-Molekülen von der DNA mit voranschreitender HR war kaum beeinträchtigt. Dies deutete darauf hin, dass ATRX erst nach der Entfernung von Rad51 durch Rad54 in die HR involviert ist. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass ATRX mit PCNA (proliferating cell nuclear antigen) interagiert, welches bekanntermaßen am nachfolgenden Schritt der DNA-Synthese beteiligt ist. Desweiteren konnte eine PIP box innerhalb der Proteinstruktur von ATRX nachgewiesen werden, welche möglicherweise die Interaktion mit PCNA vermittelt. Zusammengefasst wurde eine neue Funktion von ATRX entdeckt, welche unabhängig von bereits beschriebenen Aufgaben während der Replikation in der S-Phase ist. ATRX ist in die HR-Reparatur von DSBs in der G2-Phase involviert und interagiert hierbei mit PCNA.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 12 Sep 2016 11:37
Last Modified: 04 Aug 2017 22:04
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-56598
Referees: Layer, Prof. Paul and Cardoso, Prof. Cristina
Refereed: 4 August 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5659
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