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Untersuchungen zur Prozessierung von Intermediaten der DNA-Doppelstrangbruchreparatur in der Mitose nach Bestrahlung in der G2-Phase

Wess, Johannes :
Untersuchungen zur Prozessierung von Intermediaten der DNA-Doppelstrangbruchreparatur in der Mitose nach Bestrahlung in der G2-Phase.
Technische Universität Darmstadt, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2016)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Untersuchungen zur Prozessierung von Intermediaten der DNA-Doppelstrangbruchreparatur in der Mitose nach Bestrahlung in der G2-Phase
Language: German
Abstract:

Der DNA-Doppelstrangbruch (DSB) zählt zu der schwerwiegendsten Form von DNA-Läsionen. Er kann endogen als Folge von Replikationsstress, im Zuge der Meiose und der V(D)J-Rekombination sowie durch freie Radikale, die während des natürlichen Metabolismus der Zelle freigesetzt werden, induziert werden. Ebenso können DSBs exogen durch chemische Substanzen oder durch die Wechselwirkung mit ionisierender Strahlung verursacht werden. DSBs können zu Genmutationen führen, die die korrekte Proteinbiosynthese und damit die Funktion wichtiger Proteine gefährden. Sofern es sich dabei um Proteine handelt, die das Zellwachstum regulieren, kann dies ein unkontrolliertes Wachstum der Zellen zur Folge haben und dadurch das Risiko einer Tumorgenese erhöhen. Beim Eintritt einer DSB-geschädigten Zelle in die Mitose oder Meiose, kann es zu einer fehlerhaften Chromatiden- oder Chromosomenteilung und daraus resultierend zu einer Gefährdung der genomischen Integrität der Tochterzellen bzw. nachfolgender Generationen kommen. Allerdings verfügt die eukaryontische Zelle mit der Nicht-homologen Endverknüpfung (NHEJ) und der homologen Rekombination (HR) über Reparaturmechanismen, um DSBs zu reparieren. Darüber hinaus ermöglicht im Rahmen der DNA-Schadensantwort das enge Zusammenspiel von Zellzykluskontrolle und DNA-Reparatur durch die Aktivierung unterschiedlicher Zellzykluskontrollpunkte (Checkpoints) eine Arretierung von geschädigten Zellen an bestimmten Punkten im Zellzyklus. Dies gewährt den DNA-Reparaturmechanismen mehr Zeit für die Reparatur und unterbindet somit ein Mitführen von DNA-Schäden in die darauffolgende Zellzyklusphase. Nach abgeschlossener Reparatur wird der jeweilige Checkpoint wieder aufgehoben und die Zelle in die entsprechend nächste Zellzyklusphase entlassen. Frühere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten in humanen Zellen dem G2/M-Checkpoint jedoch eine Insensitivität gegenüber DSBs nachweisen und zeigen, dass G2-Phasezellen nach Bestrahlung mit ionisierender Strahlung mit unreparierten DSBs in die Mitose eintreten. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass zum Zeitpunkt der Checkpointaufhebung die Reparatur über den Mechanismus der HR noch nicht abgeschlossen ist. Diese beiden Erkenntnisse führten gemeinsam zu der Hypothese, dass der G2/M-Checkpoint vor Abschluss der Reparatur aufgehoben wird und folglich G2-Phasezellen mit intermediären Reparaturstrukturen der HR, wie D-Loops oder Holliday Junctions, in die Mitose eintreten. Im Rahmen dieser Arbeit sollte diese Hypothese näher untersucht werden sowie der Frage nach der weiteren Prozessierung der möglichen intermediären Reparaturstrukturen in der Mitose nachgegangen werden. Im ersten Teil der Dissertation konnten in Übereinstimmung mit den früheren Beobachtungen auch im CHO-Zellsystem dem G2/M-Checkpoint nach Bestrahlung eine Insensitivität gegenüber DSBs sowie eine Aufhebung des Checkpoints zu Zeiten, zu denen die Reparatur über den Mechanismus der HR noch aktiv ist, nachgewiesen werden. Mit Hilfe von DSB-Reparaturuntersuchungen konnte auf die Existenz von intermediären Reparaturstrukturen der HR, wie D-Loops oder Holliday Junctions, in der Mitose geschlossen werden. Darüber hinaus konnte diesen Strukturen eine stabilisierende Wirkung auf das Chromatin nachgewiesen werden, welche im Zuge der Chromatinkondensation eine Umwandlung von DSBs in Chromatidbrüche unterbindet und somit einen weiterern Beitrag zur Wahrung der genomischen Integrität der Zelle beigesteuert. Zudem wurde bei den Analysen in fixierten CHO wt-Zellen ein strahleninduzierter Anstieg des γH2AX-Focilevels von Metaphase zu Anaphase beobachtet, während dieser Anstieg auf Chromatidbruchebene sowie generell bei HR-Mutanten ausblieb. Daraus entwickelte sich die Hypothese, dass es im Zuge der HR während der Stranginvasion zu einer Übertragung des H2AX-Phosphorylierungssignals vom geschädigten Strang auf den intakten Donorstrang kommt. In fixierten Metaphase-Zellen erscheinen die beiden in enger räumlicher Nähe zueinander liegenden γH2AX-Foci methodenbedingt als einzelner Focus und können erst nach der Chromatidentrennung während der Anaphase als zwei einzelne Foci detektiert werden. Durch die Etablierung einer neuen Methode in unserem Labor, die die Immunfluoreszenzfärbung mit der Chromosomenstudie kombiniert und dadurch γH2AX-Focianalysen auf kondensierten Chromosomen ermöglicht, konnte die Existenz von paarigen, auf beiden Schwesterchromatiden gegenüberliegenden γH2AX-Foci auch in der Metaphase nachgewiesen werden. Entgegen der anfänglichen Annahme zeigten weitere Analysen allerdings, dass die Generierung der γH2AX-Doppelfoci auf einen HR-unabhängigen Mechanismus zurückzuführen ist. Im zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Auflösung der in der G2-Phase induzierten HR-Intermediate hauptsächlich in der darauffolgenden, frühen Mitose erfolgt und u. a. durch die Endonuklease Mus81 katalysiert wird. Im Zuge der Chromatiden¬trennung während der Anaphase verhindert dies ein mechanisches Auseinanderreißen der Chromatin-Verwickelungen durch die Zugkräfte des Spindelfaserapparates und bewahrt dadurch die Zelle vor der Generierung komplexer, schwer reparierbarer DSBs.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The DNA double-strand break (DSB) is one of the most toxic lesions. DSBs can endogenously be induced as a result of replication stress, during meiosis and V(D)J recombination, or by free radicals, which are generated during metabolism. Exogenously, DSBs can be induced by chemical agents or ionising radiation (IR). DSBs can lead to gene mutations which may jeopardize accurate protein synthesis and thereby cause dysfunction of essential proteins. Defective proteins which are involved in cell cycle regulation may cause uncontrolled cell division and by that, increase the risk of tumorgenesis. Entering mitosis or meiosis with DSBs may result in an incorrect segregation of sister chromatids or chromosomes and jeopardize genome integrity of the cell and next generations, respectively. To maintain the integrity of their genomes, eukaryotes have evolved cellular networks, including mechanisms of DNA repair, activation of cell cycle checkpoints, regulation of transcriptional programs and initiation of apoptosis, collectively termed the DNA damage response (DDR). DSBs are repaired by two major pathways, the non-homologous end-joining (NHEJ) and the homologous recombination (HR). By activating checkpoints, cells are arrested at specific stages within the cell cycle to allow longer repair times and to prevent progression into critical cell cycle phases with unrepaired DNA damage. After completion of repair, checkpoints are abrogated and the cells are released into the next cell cycle phase. Previous studies in human cells have demonstrated an insensitivity of the G2/M checkpoint to DSBs. After IR, the G2/M checkpoint is rapidly initiated but cells are released from G2 arrest with unrepaired DSBs, exhibiting 10 - 20 DSBs in mitosis. Furthermore, it has been shown that DSB repair by HR is still in progress at the time of G2/M checkpoint abrogation. These observations suggest that the G2/M checkpoint is abrogated prematurely before DSB repair is completed and cells enter mitosis with DNA structures like D-loops or Holliday juncions which arise during intermediate stages of HR. The aim of this study was to investigate this hypothesis and the dissolution of these possible HR intermediates in mitosis. In the first part of this work the insensitivity of the G2/M checkpoint and the abrogation of the G2/M checkpoint at a point when HR was still in progress was confirmed in CHO cells. The existence of HR repair intermediates in mitosis was pointed out by various DSB analysis. Furthermore, these analysis revealed that HR intermediates stabilize and prevent DSBs from being converted into chromatid breaks during chromatin condensation. γH2AX foci analysis in fixed G2-irradiated wt cells displayed an increase of the γH2AX foci level from metaphase to anaphase, while this increase was not observed in HR mutants and in chromatid break analysis. This primarily suggested that the H2AX phosphorylation signal is transfered from the damaged DNA strand to the donor strand during the strand invasion step of HR. By combining the chromosomal studies with the immunofluoresence technique, a method was established in our lab which allowed γH2AX foci analysis on chromosome spreads and thereby more precise investigations on this assumption. Although paired γH2AX foci were detected at opposite positions of sister chromatids, further experiments reveal an HR-independent generation of these foci, disproving the primarily hypothesis. The second part of this work focused on the resolution of HR intermediate structures. Analysis of sister chromatid exchanges (SCEs) demonstrated that IR-induced HR intermediates of G2-phase cells are resolved in mitosis in an Mus81-dependent manner. Thus, Mus81 serves to prevent the chromatin entanglements from being torn apart by the spindle apparatus during segregation and thereby prevents the de novo formation of complex DSBs.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 18 Jul 2016 12:03
Last Modified: 18 Jul 2016 12:03
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-55759
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus and Taucher-Scholz, Prof. Dr. Gisela
Refereed: 7 July 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5575
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