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Alternatives Spleißen unter Hypoxie in humanen Endothelzellen

Kemmerer, Katrin :
Alternatives Spleißen unter Hypoxie in humanen Endothelzellen.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Alternatives Spleißen unter Hypoxie in humanen Endothelzellen
Language: German
Abstract:

Hypoxie spielt eine bedeutende Rolle in vielen pathologischen Prozessen wie bei vaskulären Erkrankungen oder auch Tumoren. Während die transkriptionelle Anpassung schon intensiv untersucht wurde, wurde der posttranskriptionellen Regulation bisher wenig Beachtung geschenkt. Insbesondere das alternative Spleißen eröffnet eine Möglichkeit der schnellen und sehr spezifischen Anpassung an sich ändernde Umgebungen. In dieser Arbeit wurden deshalb zwei Gene untersucht, die beide unter Hypoxie in Endothelzellen alternativ gespleißt werden. Das erste der beiden Gene ist der MYC assoziierte Faktor X (MAX), ein ubiquitär exprimierter Transkriptionsfaktor in einem Netzwerk, das die Proliferation und Zelldifferenzierung reguliert. MAX wurde als eines von neun alternativ gespleißten Genen in einem Exon Array identifiziert. Während Hypoxie die Expression anderer Mitglieder des Netzwerkes ändert, wurden bisher keine Änderungen in der MAX Expression gefunden. In Endothelzellen werden zwei MAX mRNA Isoformen induziert, die sich an ihrem 3’ Ende vom Wildtyp unterscheiden. Isoform C wird durch den NMD (nonsense-mediated mRNA decay) abgebaut, während Isoform E für ein instabiles Protein mit einem veränderten C-Terminus kodiert. Diese Destabilisierung wird durch die Isoform E spezifische 36 aa lange Sequenz vermittelt, die auch in der Lage ist, heterologe Proteine durch Fusionieren an deren C-Terminus zu destabilisieren. Beide Spleißereignisse sind demnach unproduktiv und scheinen vielmehr der Reduktion des Wildtyps unter Hypoxie zu dienen. Durch neuere Studien wurde gezeigt, dass deregulierte Spleißfaktoren zum Fortschreiten von Tumoren beitragen können. Um die Regulation solcher Proteine besser zu verstehen, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit das alternative Spleißen des RNA bindenden Proteins hnRNP DL charakterisiert. Unter Hypoxie wird eine unproduktive mRNA Isoform durch Inklusion eines Exons im 3’ UTR induziert, die durch Abbau im NMD zu einer geringeren Proteinmenge in Endothelzellen führt. Eine reduzierte Menge von hnRNP DL konnte mit einer reduzierten Proliferation in Endothelzellen assoziiert werden. HnRNP DL ist in der Lage, das Spleißen der eigenen prä-mRNA zugunsten der NMD sensitiven Isoform zu verschieben. Diese Autoregulation ist mit einem ultrakonservierten Element verbunden und wurde bereits für mehrere Mitglieder der hnRNP Familie beschrieben. Durch Minigen-Analysen konnte die Bindesequenz von hnRNP DL auf 50 nt auf- oder abwärts des alternativen Exons eingegrenzt werden. Außerdem konnte eine gegenseitige Regulation der paralogen Proteine hnRNP D und DL in HeLa-Zellen bestätigt werden. Die Proteine regulieren somit die eigene sowie die gegenseitige Expression durch einen negativen feedback loop. Diese Art der Crossregulation ist auch für andere paraloge hnRNPs beschrieben worden, jedoch anders als hier gezeigt, keine Regulation in beide Richtungen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Hypoxia is part of many physiological and pathophysiological processes, including cancer and cardiovascular diseases. Endothelial cells form the inner lining of blood vessels and initiate an orchestrated gene response under hypoxia, as they are the first cells sensing reduced oxygen conditions. The transcriptional response to hypoxic conditions is already well understood. In contrast, the knowledge about the posttranscriptional gene regulation is just beginning to emerge. Alternative splicing is one possibility to adapt the transcriptome to new conditions and serves as a platform of tissue specific adaptation. In this study two genes were analyzed, both are alternatively spliced under hypoxia. MAX (MYC associated factor X) is the central part in the MYC/MAX/MXD network of transcriptional regulators involved in apoptosis, differentiation and proliferation. MAX was identified as one of nine genes in an exon array analysis. Under prolonged hypoxic conditions, cells decrease their energy consumption through a decrease of proliferation rate. Hence, MYC protein is downregulated, counteracted by an upregulation of its antagonist MXD2. Until now, no regulation of MAX has been reported under hypoxia. In addition to the wildtype protein, two mRNA isoforms encoding C-terminal truncated MAX variants arise from alternative splicing. These are created either by retention of intron 4 (isoform E) or by inclusion of a cassette exon encoded within intron 4 (isoform C). Both C-terminal isoforms have been shown to enhance the transforming activity of c-MYC in vivo, whereas the wildtype reduces it. We show that during hypoxia both mRNAs encoding C-terminal truncated MAX variants are upregulated in endothelial cells, whereas the wildtype is reduced on mRNA and protein level. Upregulation of these mRNAs, however, does not lead to a detectable production of the corresponding protein isoforms. Isoform C is targeted to the nonsense-mediated decay (NMD) pathway. Isoform E encodes a highly unstable protein, with the last 36 aa inducing an extremely efficient downregulation also when attached to heterologous proteins. Therefore, the sole purpose of this intricate splicing regulation seems to be the reduction of wildtype protein level. As MAX is part of all MYC and MXD heterodimers, its reduction impacts on the activity of the whole network. Recent studies revealed, that deregulated splicing factors may impact on tumor progression. To gain detailed insights into the regulation of splicing factors, the alternative splicing of the RNA binding protein hnRNP DL (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like) was analyzed in the second part of this work. Under hypoxia, two splice variants were identified, differing in an alternative exon, located in the hnRNP DL 3’UTR. The mRNA containing exon 8 is increased upon oxygen starvation (48 h, 1% O2) in endothelial cells. This upregulated isoform is a target for the NMD. Therefore, alternative splicing during hypoxia leads to a decrease in the protein coding mRNA isoform and subsequently to reduced protein levels. Knockdown of hnRNP DL leads to reduced proliferation of endothelial cells, supporting a general role in cell proliferation. Additionally, analysis of the splicing regulation revealed that hnRNP DL regulates its own expression in a negative feedback loop. HnRNP DL does so by binding to its pre-mRNA, favoring inclusion of exon 8. Minigene analyses identified an intronic binding sequence 50 nt up- or downstream of exon 8. A crossregulation between the paralogous proteins hnRNP DL and hnRNP D was shown in HeLa cells. Hence, both proteins regulate their own expression as well as the expression of the other protein, respectively. This kind of crossregulation was observed for other hnRNPs before, but unlike shown here, the regulation was restricted to only one direction.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 20 Dec 2017 09:40
Last Modified: 20 Dec 2017 09:40
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-55535
Referees: Suess, Prof. Dr. Beatrix and Cardoso, Prof. Dr. Cristina
Refereed: 17 June 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5553
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