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In vitro und in vivo Studien zeigen konservierte Eigenschaften des RNAi-Mechanismus’ in Trypanosoma brucei

Best, Alexander :
In vitro und in vivo Studien zeigen konservierte Eigenschaften des RNAi-Mechanismus’ in Trypanosoma brucei.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2005)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: In vitro und in vivo Studien zeigen konservierte Eigenschaften des RNAi-Mechanismus’ in Trypanosoma brucei
Language: German
Abstract:

RNA interference (RNAi) ist ein posttranskriptioneller gene silencing Mechanismus, der in Protozoen, Pilzen, Pflanzen und Tieren nachgewiesen werden konnte. Der Auslöser ist doppelsträngige RNA (dsRNA), die zur sequenzspezifischen Degradation homologer mRNA-Moleküle führt. Im RNAi Initiationsschritt wird zunächst dsRNA durch die Ribonuklease Dicer in so genannte short interfering RNAs (siRNAs) prozessiert. Diese weisen eine Länge von 21 – 26 Nukleotiden auf. Zusätzliche Proteine assoziieren danach mit je einem siRNA-Molekül und bilden den RNA induced silencing complex (RISC). Im anschließenden Effektorschritt kommt es dann zur Erkennung und Degradation der Ziel-mRNA. Dabei erfolgt die Erkennung durch die Ausbildung komplementärer Basenpaarungen zwischen der siRNA und dem Zielmolekül. Die abschließende Degradation der mRNA wird durch eine endonukleolytische Aktivität des RISCs katalysiert. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der biochemischen Charakterisierung des RNAi-Mechanismus’ in dem humanpathogenen Parasiten Trypanosoma brucei. Es wurden zwei in vitro Assays etabliert, die sowohl den Initiations- als auch den Effektorschritt der RNAi-Reaktion rekapitulieren. Darüber hinaus wurde ein in vivo Assay entwickelt, der die Identifizierung neuer RNAi-Komponenten ermöglicht. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1) Die biochemische Charakterisierung des RNAi-Initiationsschrittes in Trypanosoma brucei ist konsistent mit der Beteiligung von Domänen, die von Dicer-Orthologen anderer Spezies bekannt sind. So impliziert die terminale Prozessierung der dsRNA die Beteiligung einer PAZ-Domäne. Die Abhängigkeit dieser Reaktion von hydrolysierbaren Adenosinphosphaten ist konsistent mit einer Helikaseaktivität. Darüber hinaus weisen die strukturellen Charakteristika der Reaktionsprodukte sowie die Abhängigkeit der dsRNA-Prozessierung von Magnesiumionen auf die Beteiligung einer RibonukleaseIII-Domäne hin. 2) Strukturelle Analysen der siRNAs aus T. brucei zeigen Eigenschaften, die von siRNAs aus anderen Systemen bekannt sind. Die in vitro Charakterisierung des Effektorschrittes weist auf eine RISC-typische Reaktion hin, in der siRNAs die Position der mRNA-Hydrolyse spezifizieren. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Transfektion synthetischer siRNAs knockdown-Phänotypen in T. brucei auslösen können. Dabei weisen funktionelle siRNAs eine vergleichsweise höhere thermodynamische Stabilität am 5’-Ende als am 3’ Ende des sense-Stranges auf. 3) Es wurde das so genannte „RNAi in vivo System“ etabliert, das die Identifizierung von RNAi-Komponenten in T. brucei ermöglicht. Dabei können individuelle Gene mit Hilfe einer transgenen Zelllinie getestet werden. Der Nachweis von RNAi-Komponenten erfolgt über die heterologe Expression eines Reportergens, das ein fluoreszierendes Protein codiert. Der in vivo Assay wurde mit der RNAi-Komponente TbAGO1 und α-Tubulin als unabhängige Kontrolle getestet. Die Quantifizierung der Fluoreszenz ergab dabei erwartungsgemäß 10-fach höhere Werte für TbAGO1 als für die Negativkontrolle. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass der RNAi-Mechanismus in T. brucei konservierte Eigenschaften aufweist. Die etablierten in vitro und in vivo Systeme ermöglichen die Identifizierung und die biochemische Charakterisierung neuer RNAi-Komponenten in T. brucei. Als Perspektive kann die Transfektion synthetischer siRNAs dazu genutzt werden, ein genomweites screening nach potentiellen Wirkstoffzielen im Parasiten durchzuführen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
RNA interference (RNAi) is a posttranscriptional gene silencing mechanism which has been identified in protozoa, fungi, plants and animals. The trigger is double stranded RNA (dsRNA), which mediates a sequence specific degradation of cognate mRNA molecules. In the initiation step of the reaction the dsRNA is processed by the ribonuclease Dicer into 21–26 nt short interfering RNAs (siRNAs). Additional proteins bind to siRNAs thereby forming the so-called RNA induced silencing complex (RISC). In the following effector step the target mRNA base-pairs with the siRNA in the ribonucleoprotein complex and becomes degraded by an endonucleolytic activity of the RISC. The present study aimed at a biochemical characterization of the RNAi mechanism in the pathogenic parasite Trypanosoma brucei. Two in vitro assays were established that recapitulate the initiation and the effector step of the RNAi reaction. In addition, an in vivo assay was developed for the identification of novel RNAi components.The following results were obtained: 1) The biochemical features of the RNAi initiation step in Trypanosoma brucei is consistent with the participation of functional domains known from other Dicer orthologs. The terminal processing reaction of the dsRNA suggests the involvement of a PAZ domain. The requirement for a hydrolysable adenosinephosphate is consistent with a helicase function. Structural characteristics of the siRNAs and the requirement for Mg2+ cations suggest an RNaseIII activity in the initiation step. 2) The structural analysis of siRNAs in T. brucei revealed conserved features known from siRNAs in other systems. The in vitro characterization of the effector step indicates a RISC-like reaction in which siRNAs specify the position of the mRNA hydrolysis. Moreover, transfection of synthetic siRNAs induce gene knock down phenotypes in T. brucei. Terminal sequences determine the knockdown efficiency of the siRNAs. Functional siRNAs reveal a higher thermodynamic stability at the 5’ end in comparison to the 3’ end of the sense strand. 3) An “RNAi in vivo system” was established, which provides the opportunity to identify essential components involved in the RNAi reaction. Individual genes can be tested using a transgenic cell line of Trypanosoma brucei. RNAi components can thereby be identified by the heterologous expression of a fluorescent protein encoding reporter gene. The in vivo assay was tested with the RNAi component TbAGO1 and α tubulin as an unrelated control. The quantification revealed a 10 fold increased fluorescence for TbAGO1 compared to the negative control. Together, the mechanistic details of the RNAi reaction in T. brucei resemble the conserved characteristics of the silencing reaction in higher eukaryotes. The established in vivo and in vitro systems enable the identification and characterization of novel RNAi components in T. brucei. Lastly, siRNAs can be designed for genome-wide screening assays for the identification of potential drug targets within the parasite.English
Uncontrolled Keywords: RNA interference, RNAi, posttranscriptional gene silencing, knock down, knockdown, in vivo assay, in vitro assay, RNA induced silencing complex, Dicer
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
RNA interference, RNAi, posttranscriptional gene silencing, knock down, knockdown, in vivo assay, in vitro assay, RNA induced silencing complex, DicerEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:51
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000549
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-5491
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Göringer, Prof. Dr. H. U. and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Advisors: Göringer, Prof. Dr. H. U.
Refereed: 4 February 2005
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/549
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