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Peptidic inhibitors of therapeutically relevant proteases: Design, synthesis, and functional evaluation

Fittler, Heiko :
Peptidic inhibitors of therapeutically relevant proteases: Design, synthesis, and functional evaluation.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Heiko Fittler_Dissertation 2016.pdf - Accepted Version
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Peptidic inhibitors of therapeutically relevant proteases: Design, synthesis, and functional evaluation
Language: English
Abstract:

In dieser kumulativen Arbeit wurden durch strukturbasiertes Wirkstoffdesign neue Inhibitoren auf Basis des Gerüstes des sunflower trypsin inhibitor-1 (SFTI-1) Peptids gegen krankheitsrelevante Serinproteasen generiert und untersucht. Die erste Studie (Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 7753-7762) demonstriert den Nutzen von SFTI-1 als Gerüstmolekül für Modellierungen und Dockingversuche. Es wurde gezeigt, dass der Austausch eines wichtigen Strukturmotives von SFTI-1[1,14], seine Disulfidbrücke, durch unterschiedlich substituierte 1,2,3-Triazole nur dann gegen die Modellprotease Trypsin erfolgreich ist, wenn die neue Struktur mit der ursprünglichen nahezu identisch ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Ergebnisse einer in silico Studie mit den experimentellen Daten der Inhibitionsversuche verschiedener Peptide gegen die krankheitsbezogene Protease Matriptase-1 verglichen. Daraus ergab sich, dass beide Datensätze ein nahezu gleiches Ergebnis lieferten, nämlich eine geringe Affinität zu dem Zielprotein. Dies überrascht, da die Oberfläche von Matriptase-1 in der Nähe des aktiven Zentrums negativ und SFTI-1[1,14] positiv geladen ist. Um dies zu verstehen, wurden die berechneten freien Energien der Verbindungen aus den in silico und in vitro Daten miteinander verglichen, wobei sich diese als nahezu identisch herausstellten. Daraus lässt sich schließen, dass die geminderte Affinität durch negative entropische Beiträge der C-terminalen Region dafür verantwortlich ist. Folglich sollte eine C-terminale Verkürzung oder der Austausch von bestimmten Aminosäuren die Bindungsaffinität gegenüber Matriptase-1 erhöhen. Aus den Daten der in silico Studie folgt, dass die monozyklische Variante von SFTI-1 (SFTI-1[1,14]) als Ausgangsmolekül für weitere Verbesserungen für potentere Matriptase-1-Inhibitoren eine gute Wahl ist. Aus der Kristallstruktur des Matriptase-1-SFTI-1-Komplexes ergaben sich drei Positionen für die Austausche, die keine Bindung mit der Protease eingehen. Daher wurden die Aminosäuren Ile7 und Ile10 gegen nicht-natürliche Aminosäuren mit Azidfunktionen in der Seitenkette ausgetauscht. Mit Hilfe der Kupfer(I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) wurde mit Hilfe unterschiedlicher Alkine eine Bibliothek von 22 Peptidmimetika synthetisiert. Diese Verbindungen mit 1,2,3-Triazolen wurden in einem Inhibitionstest gegen Matriptase-1 auf ihre Aktivität hin untersucht. Zusätzlich wurde Phe12 durch weniger raumfüllende kanonische Aminosäuren ersetzt. Nur die Austausche an den Positionen 10 und 12 führten zu einer Verbesserung der Inhibition gegen Matriptase-1 im Vergleich zu dem Wildtyp SFTI-1[1,14]. Die Triazolvariante mit einem Amin in der Seitenkette an Position 10 wurde durch die positiv geladenen kanonischen Aminosäuren Lysin und Arginin ersetzt. Erstaunlicherweise hatten beide Austausche eine bessere Inhibitionskonstante als ihr Vorgänger. Dabei war die Variante mit einem Arginin affiner als mit einem Lysin. Das Peptid, das beide Verbesserungen an den Positionen 10 und 12 in sich trägt, besitzt eine Inhibitionskonstante Ki von 11 nM (703 nM für den Wildtyp SFTI-1[1,14]) und wurde daraufhin als SFTI-1 derived matriptase inhibitor-1 (SDMI-1) bezeichnet. Diese Variante beinhaltet nur kanonische Aminosäuren und ist somit leicht durch automatische Festphasensynthese zugänglich. Die nächste Studie beschäftigte sich mit der Suche nach einer adressierbaren Position im Molekül für den Einbau von maßgeschneiderten funktionellen Gruppen. Diese wird z.B. für die Oligomerisierung des Inhibitors oder die Konjugation an ausgewählte Gerüstmoleküle wie einen Antikörper oder ein C4b-Bindeprotein (dort können alle sieben α–Helices adressiert werden) benötigt. Dafür wurden verschiedene Positionen auf ihre Austauschbarkeit untersucht, aber der jeder dieser Austausche führte zu einer erheblichen Verminderung der inhibitorischen Aktivität. Natürlich kann eine neue Gruppe einfach an den N-terminus gekoppelt werden. Die Verlängerung der Kette durch ein Fluorophor sorgte allerdings ebenfalls für einen starken Verlust der Inhibition (Ki = 328 nM). Andererseits hatte die Zyklisierung des N- und C-Terminus keine negative Auswirkung auf die Inhibition. Aus diesem Grund scheint die fehlende Ladung des freien Amins nicht das Problem zu sein, sondern die ungünstige Wechselwirkung des Fluorophors mit der Oberfläche der Protease. Deshalb wurde ein e-Fmoc geschütztes Lysin an die erste Position eingebaut. Dadurch kann nach der Entschützung der Seitenkette der Einbau der gewünschten Funktionalität genutzt werden. Die Verbindung mit Lys1 besitzt eine Inhibitionskonstante Ki von 2,1 nM und ist damit potenter als ihre Vorgänger, sie wurde daraufhin als SDMI-3 bezeichnet. Die Kopplung von verschiedenen Reportermolekülen, wie Fluorophoren oder anderen Verbindungen, zeigte nur einen geringen Verlust an Affinität gegenüber Matriptase-1. Somit ließ sich SDMI-3 an verschiedene oligovalente Biomoleküle konjugieren, die zu Tetrameren im Falle des Fc-Fragmentes eines Antikörpers oder sogar zu einem Heptamer im Falle des C4b-Bindeprotein führte. Die verbesserten Varianten aus den vorangegangen Studien wurden als Startpunkt für die Entwicklung neuartiger Furininhibitoren genutzt. Diese Protease steht im Zusammenhang mit Alzheimer, Krebs, Arteriosklerose und anderen Krankheiten. Der Wildtyp SFTI-1[1,14] zeigt nur eine moderate Inhibition von Furin (Ki = 35 µM), aber SDMI-3 erwies sich mit 24,1 nM bereits als potente Verbindung. Der Einbau der Furinsubstratsequenz (Arg-X-Arg/Lys-Arg↓) in SDMI-3 führte zu keiner Verbesserung der Inhibition. Interessanterweise erwies sich ein Arginin an der P1-Position in diesem Fall nicht optimal. Allerdings führte der Austausch gegen ein Lysin zu einer affineren Variante. Darüber hinaus sorgte der Austausch von neutralen gegen positiv geladene Aminosäuren für eine bessere Inhibition mit der negativ geladenen Oberfläche der Peptidase. Zusätzlich zeigte das in silico Modell keine ausgeprägte Wechselwirkung zwischen der C-terminalen Region und der Furin-Oberfläche. Daraufhin wurden verkürzte Varianten synthetisiert, bei denen die Aminosäuren 13-14 bzw. 12-14 fehlten. Beide Minimierungen hatten einen großen Einfluss auf die Aktivität der beiden Verbindungen mit Inhibitionskonstanten von 0,49 und 0,71 nM gegenüber Furin. Die aktivere Variante mit 12 Aminosäuren wurde daraufhin als SFTI-derived furin inhibitor (SDFI) bezeichnet. Die neu, nach rationalen Kriterien designten Peptide SDMI-3 und SDFI sind vielversprechende Varianten, die in der Nuklearmedizin mit radioaktiven Markierungen zum Beispiel in der Tumordiagnostik eingesetzt werden könnten. Dafür wären die Verfahren der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT) hervorragend geeignet.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
This cumulative thesis relies on the studies comprising structure-based drug design towards novel, potent inhibitors of disease-related serine proteases on the scaffold of sunflower trypsin inhibitor-1 (SFTI-1) peptide. Our initial study (Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 7753-7762) revealed the utility of SFTI-1 as a scaffold for computational design. Thus, the replacement of an important structural motif of SFTI[1,14], namely its disulfide bridge, against differently substituted 1,2,3-triazoles showed that inhibitory activity against a model protease trypsin was only preserved if the resulting architecture matched that of the parent peptide. Therefore, in the following investigation these in-silico modeled synthetic compounds were examined in the assays with the disease-related peptidase matriptase-1 and showed marginal affinity to this target. It was a surprising outcome taking into consideration that surface of matriptase-1 is negatively charged around the active site and SFTI-1[1,14] is charged positively. To explain this effect, the in silico calculated free energies for every inhibitor-enzyme complex were compared with those resulted from the in vitro data, and almost a perfect match was obtained. Therefore, the feasible explanation for the impaired binding could be an entropic penalty from the C-terminal loop region. Therefore, its truncation or replacement of certain amino acids could increase the binding potency towards matriptase-1. The data obtained from the in silico study implied usage of the monocyclic version of SFTI-1 (SFTI-1[1,14]) as starting scaffold towards generation of more potent matriptase-1 inhibitors. From the crystal structure of the matriptase-1-SFTI-1 complex, three positions within the peptide were identified for substitutions. Thus, amino acids Ile7 and Ile10 were exchanged against non-natural azide-bearing amino acids and successive copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) with different alkyne counterparts resulted in the library of 22 peptide mimetics. This 1,2,3-triazole-bearing compounds were examined in the inhibition assays against matriptase-1. Additionally, Phe12 was replaced by natural amino acids with less bulky side chains. Only the substitutions at position 10 and 12 led to improved, compared to the wildtype SFTI-1[1,14], affinity. The triazolyl amine at position 10 was replaced by positively charged canonical amino acids Lys, respectively, Arg. Surprisingly, both were more potent than the parent compound, with the arginine-bearing one being the most active inhibitor. The peptide possessing a combination of the two most beneficial replacements and a Ki of 11 nM (703 nM for the wildtype SFTI-1[1,14]) was named SFTI-1-derived matriptase inhibitor-1 (SDMI-1). This engineered SDMI-1 peptide contained exclusively canonical amino acids and was readily accessible by automated Fmoc-SPPS. The next study was focused on the additional addressable site for the installation of tailor-made functionalities. This is needed to get access to oligomeric inhibitors via e.g. covalent grafting onto certain oligovalent scaffolds like an antibody or a C4b-binding protein (all seven α-helices of C4bp can be addressed). To this end, different positions were examined towards exchanges, but the decline of inhibitory activity against matriptase-1 was too significant. Obviously, attachment of novel functionalities could be achieved via the free N-terminus which is easily accessible by standard amide coupling. However, the elongation by a fluorophore group at the beginning of the peptide sequence resulted in a decrease of the inhibitory activity (Ki = 328 nM). On the other hand, the potency of the head-to-tail cyclized peptide was not impaired. Therefore, the decrease of binding capacity was presumably caused by a repulsion of the peptidase’s and inhibitor’s surfaces rather than by missing positive charge at the amino terminus. Therefore, an ε-Fmoc-protected lysine was incorporated at the first position and, following deprotection, its side-chain was used for the installation of desired functionalities. This new molecule, being with its Ki of 2.1 nM more potent as the precursor, was called SDMI-3. The coupling of different reporters, e.g. fluorophores or other motifs, showed only minor loss of potency against matriptase-1. Therefore, it was possible to conjugate SDMI-3 to different oligovalent biomolecular scaffolds, leading to tetrameric constructs upon coupling with the Fc part of an antibody or even heptamers in the case of the C4bp. These results are not included in this work. The improved variants obtained in the previous studies were used as a starting point for the development of novel inhibitors of furin, a protease associated with Alzheimer`s disease, cancer, atherosclerosis and other pathologies. The wildtype SFTI-1[1,14] showed only moderate inhibition of furin (Ki = 35 µM) but SDMI-3 had a potency of 24.1 nM and became a good lead. The incorporation of the furin substrate sequence (Arg-X-Arg/Lys-Arg↓) did not result in a better binding. Interestingly, although in all furin inhibitors an Arg at the P1 position is fixed, the substitution against a Lys resulted in a much more potent compound. The replacement of neutral amino acids against positively charged ones showed improved binding with the negatively charged surface of the peptidase. Furthermore, the in silico model showed no pronounced interaction between the C-terminal region and the furin surface. Hence, truncated versions lacking amino acids 13-14 and 12-14 were synthesized. Both deletions had a prominent effect on the activity, leading to sub-nanomolar Ki’s (0.49 and 0.71 nM, respectively), and the most active compound was named SFTI-derived furin inhibitor (SDFI). The engineered peptides SDMI-3 and SDFI are valuable leads that can be used as scaffolds for in radio-labeling, liquid scintillation counting (LSC), single-photon emission computed tomography (SPECT) and positron emission tomography (PET).English
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 133 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 01 Mar 2016 13:10
Last Modified: 01 Mar 2016 13:10
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-53349
Identification Number: 0000-0001-7027-9121
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Schmitz, Prof. Dr. Katja and Buntkowsky, Prof. Dr. Gerd and Biesalski, Prof. Dr. Markus
Refereed: 8 February 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5334
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