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Application of high-resolution membrane capacitance measurements in the study of exocytosis and endocytosis in Saccharomyces cerevisiae

Carrillo, Lucia :
Application of high-resolution membrane capacitance measurements in the study of exocytosis and endocytosis in Saccharomyces cerevisiae.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Application of high-resolution membrane capacitance measurements in the study of exocytosis and endocytosis in Saccharomyces cerevisiae
Language: English
Abstract:

High resolution cell-attached patch-clamp recordings are used to analyze the kinetics of exo- and endocytosis in yeast. This technique is based on the fact that physical properties of cell membranes are comparable to the properties of a RC-circuit, consisting of a resistor and a capacitor in parallel. This means that changes in the plasma membrane surface, resulting from fusion and fission of vesicles, can be measured as changes in the membrane capacitance. Application of cell-attached patch-clamp recordings to Saccharomyces cerevisiae facilitates detection of exo- and endocytotic events, as discrete changes in the membrane capacitance at high temporal and spatial resolution. The results show four different kinetic modes of exo- and endocytosis in yeast, which were already reported from other eukaryotes. These modes include transient and permanent fusion and fission of vesicles. The measured capacitance changes were predominantly in the range of 0.2 - 1 fF, which corresponds to vesicle diameters of 90 - 200 nm. The vesicle size distribution showed a median of about 132 nm for endocytotic and 155 nm for exocytotic vesicles. Under well-defined nutrient conditions endocytotic and exocytotic events occurred at frequencies of 8.1 and 12.3 events per hour, respectively. In comparison, protoplasts deprived of glucose showed lower frequencies with nearly four events/h for exocytotic, and two events/h for endocytotic events. This result indicates energy requirement for exo- and endocytosis in yeast. Via capacitance measurements it was feasible to examine exo- and endocytosis frequencies, to determine vesicle sizes and to detect fusion pores in yeast cells. Because of the latter it was also possible to establish a rough classification of fusion pores conductance and diameters. A temperature sensitive SEC mutant sec6-4 inhibited in the secretory pathway revealed a direct relationship between recorded capacitance changes in the plasma membrane and exocytotic events. In this context cells of the aforementioned mutant were incubated at the restrictive temperature of 37 °C resulting in an accumulation of vesicles in the cytosol. After incubation 71.6 exocytotic and 16 endocytotic events/h were measured. As a control sample, cells were incubated at the permissive temperature of 25 °C. The measured frequencies were comparable to the reference strain BY4741, which results in 15.1 events/h for exocytotic and 9.2 events/h for endocytotic events. This demonstrates that event frequencies can be modulated. Through this study it was possible to demonstrate that capacity measurements can be applied to yeast cells for the detection of single fission and fusion events. Analyses on yeast protoplasts suggest that this system can be used for the investigation of exo- and endocytosis via capacity measurements. This provides a new tool for analyzing both processes in yeast.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Hochauflösende cell-attached Patch-Clamp Kapazitätsmessungen werden zum ersten Mal verwendet, um Exo- und Endozytose in Hefe zu untersuchen. Biologische Plasmamembranen haben ähnliche Eigenschaften wie Kondensatoren, deshalb weisen diese eine bestimmte Kapazität auf, die anhand der Patch-Clamp Technik bestimmt werden kann. Da die Kapazität eines Kondensators/biologischen Membran von der Oberfläche abhängt, kann man Veränderungen an der Plasmamembranoberfläche, die bespielweise durch Fusion oder Abschnürung von Vesiklen verursacht werden, als Änderungen in der Kapazität messen. Bei Anwendung von cell-attached Patch-Clamp Messungen an Saccharomyces cerevisae war es möglich einzelne exo- und endozytotische Ereignisse als Änderungen in der Plasmamembrankapazität, mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, zu detektieren. Die Ergebnisse zeigen vier unterschiedliche kinetische Typen von exo- und endozytotischen Ereignissen auf, welche ebenfalls in Eukaryoten beobachtet werden können. Sie können in transiente und permanente endo- und exozytotischen Ereignissen eingeteilt werden. Die gemessenen Kapazitätsänderungen liegen im Bereich von 0.2 - 1 fF, welche umgerechnet Vesikeldurchmesser im Größenbereich von ca. 90 - 200 nm entsprechen. Der Median der Vesikelverteilungen liegt bei ca. 132 nm für endozytotische und bei 155 nm für exozytotische Vesikel. Bei guten Nährstoffbedingungen beträgt die Frequenz 8.1 Ereignisse pro Stunde für Endozytose und 12.3 Ereignissen pro Stunde für Exozytose. Auch wenn diese Frequenzen etwas niedrig erscheinen, stimmen sie gut mit den gemessenen Daten in Hefezellen und -protoplasten überein. Protoplasten, die ohne Glukose inkubiert wurden, weisen niedrigere Frequenzen auf mit 3.8 exozytotische und zwei endozytotische Ereignisse pro Stunde. Das zeigt, dass die Protoplasten Energie für die Prozesse von Exo- und Endozytose benötigen. Darüber hinaus können neben der Bestimmung von Vesikelgrößen und der Ereignisfrequenzen, auch Fusionsporen in Hefen gemessen werden und eine grobe Einteilung der Leitfähigkeiten und der Porengrößen vorgenommen werden. Weitere Untersuchungen werden anhand einer Temperatursensitiven Mutante sec6-4 des Hefestamms SY1 durchgeführt. Durch die Mutation wird der sekretorische Weg, bei einer Inkubationstemperatur von 37 °C, inhibiert. Ziel war es, einen direkten Zusammenhang zwischen exozytotischen Ereignissen und gemessene Kapazitätsänderungen herzustellen. In diesem Zusammenhang werden die Zellen dieser Mutante bei einer einschränkenden Temperatur von 37 °C für drei Stunden inkubiert, um Vesikel im Zytosol akkumulieren zu können. Danach wurden die Zellen bei Zimmertemperatur gemessen. Pro Stunde konnten 71.6 exozytotische Ereignisse und 16 endozytotische Ereignisse gemessen werden. Als Kontrolle wurden die Zellen ebenfalls für drei Stunden bei einer nicht-einschränkenden Temperatur von 25 °C, bei der der sekretorische Weg nicht inhibiert ist, inkubiert und gemessen. Bei dieser Temperatur wurden pro Stunde 15.1 exozytotische und 9.2 endozytotische Ereignisse, ähnlich zum Referenzstamm BY4741, gemessen. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Frequenzen anhand von Mutationen im sekretorischen oder endozytotischen Weg moduliert werden können. In dieser Arbeit konnte die Methode der Kapazitätsmessungen für die Untersuchung von Exo- und Endozytose an Hefe etabliert werden. Es war zum ersten Mal möglich einzelne Vesikel in Echtzeit in Hefe aufzulösen und deren Durchmesser zu bestimmen. Außerdem konnte man auch zum ersten Mal Fusionsporen von Vesikeln in Hefe untersuchen und den Fusionsporendurchmesser bestimmen. Mit den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Hefe Protoplasten ein geeignetes System für die Untersuchung von Exo- und Endozytose durch Kapazitätsmessungen sind. Dies stellt eine weitere Untersuchungsmöglichkeit für beide Prozesse in Hefe dar.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Yeast Membrane Biology
Date Deposited: 18 Dec 2015 13:15
Last Modified: 18 Dec 2015 13:15
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-52077
Referees: Bertl, Prof. Dr. Adam and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 27 November 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5207
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