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Charakterisierung kleiner, nicht-kodierender RNAs in Streptomyces coelicolor

Heueis, Nona :
Charakterisierung kleiner, nicht-kodierender RNAs in Streptomyces coelicolor.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Charakterisierung kleiner, nicht-kodierender RNAs in Streptomyces coelicolor
Language: German
Abstract:

Die Fähigkeit von RNA-Molekülen die Regulation zellulärer Mechanismen zu steuern, wurde lange Zeit unterschätzt. RNA galt nur als Überträger von Information zwischen DNA und Proteinen. Nachdem zwischen 1954 und 1961 zunächst die Rolle der rRNA, später auch der tRNA und mRNA aufgeklärt wurde, überzeugte die Entdeckung der Selbstspaltkapazität von Ribozymen und von miRNAs schließlich vom regulatorischen Potential einer RNA ganz ohne involvierte Protein-faktoren. (Brenner et al., 1961; Hoagland et al., 1958; Kruger et al., 1982; Palade, 1955) Allein in Escherichia coli sind bis heute über 80 solcher regulatorischer RNA-Moleküle bekannt, im Menschen gibt es mehr als 1200 miRNAs. (Friedländer et al., 2014; Raghavan et al., 2011) Fast so groß wie ihre Anzahl ist auch die Vielfältigkeit ihrer Funktion. Sie regulieren die Transkription und die Translation, beeinflussen die mRNA-Stabilität und die Modulation von Proteinfunktionen. Im Modellorganismus der Actinomyceten, Streptomyces coelicolor, wurden bereits Ansätze zur Identifikation von sRNAs unternommen, bei denen eine Vielzahl an sRNA-Sequenzen identifiziert wurde. Bisher konnten für diese drei Ziel-mRNAs validiert werden. (D'Alia et al., 2010; Vockenhuber et al., 2011; Vockenhuber & Suess, 2012) In der hier vorliegenden Arbeit sollten sieben der elf in unserer Arbeitsgruppe identifizierten sRNAs aus S. coelicolor näher untersucht werden. (Vockenhuber et al., 2011) Alle ausgewählten Kandidaten zeigten eine hochstrukturierte Faltung der sRNA-Sequenz. Ihre Expressionsmuster waren sehr unterschiedlich und reichten von einer sehr starken (scr2736) über eine sehr gleich-mäßige (scr3920) Expression bis hin zu einer starken Abhängigkeit von der Wuchsphase (scr2952, scr4115, scr4389, scr4632, scr6925). Die sRNA-Sequenzen waren innerhalb der Gattung Streptomyces sehr unterschiedlich konserviert. Scr2952 wurde in nahezu allen überprüften Streptomyceten-Arten nachgewiesen, scr4632 konnte dagegen nur in S. coelicolor identifiziert werden. Die Expression der sRNA-Kandidaten und ihr Einfluss auf das Wachstum wurden unter verschiedenen Anzuchtbedingungen überprüft (verschiedene Stickstoff- und Kohlenstoffquellen sowie Stressbedingungen). Keine der sRNAs reagierte mit eindeutigen Expressions- oder Wachstums-veränderungen auf die getesten Konditionen. Die Erstellung von Überexpressionsmutanten konnte nur bei scr2952 unter Supplementierung von Citrat auf Festmedium ein verstärktes Wachstum induzieren. Die Ursache dieses Effekts konnte noch nicht geklärt werden. Von den sRNAs scr4632 und scr6925 konnte im Laufe von zwei Jahren keine Deletion erhalten werden. Es erfolgte nur eine einfache Integration der Deletionslasmide, die doppelt homologe Integration der sRNA konnte jedoch nicht erreicht werden. Dies deutet auf eine essentielle Funktion hin. Der Genotyp beider Stämme wurde über Sequenzierung bestätigt und schloss eine unspezifische Integration der Plasmide aus. Die Stämme mit der einfachen Integration dieser beiden sRNAs zeigten einen ungewöhnlichen Phänotyp. Auf Festmedium sekretierten sie eine goldene Flüssigkeit in sehr großer Menge. Eine Northern Blot-Analyse mit den Überexpressions-stämmen von scr4632 und scr6925 konnte einen ersten Hinweis auf eine mögliche gegenseitige Beeinflussung dieser sRNAs liefern. In einer Proteomanalyse konnte das Protein BldKB als mögliches Ziel der sRNAs identifiziert werden. Die weitere Untersuchung des beobachteten Phänotyps wird in Zukunft sehr spannend sein, da ein Regulationsmechanismus, der auf einer direkten gegenseitigen Beeinflussung zweier sRNAs beruht, bislang nicht beschrieben wurde.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Streptomyces coelicolor is a model organism for GC-rich, Gram-positive, soil dwelling bacteria. Due to its capacity to produce secondary metabolites such as herbicides, tumorsuppressants, immunosuppressives and especially antibiotics in ample varieties, this class of bacteria is of great industrial and therapeutic interest. S. coelicolor possesses a linear chromosome of about 8 Mbp that codes for over 7000 annotated open reading frames (ORFs). It undergoes extensive morphological changes during its complex life cycle. Growth of S. coelicolor starts as a singular spore that germinates and forms a vegetative, soil dependent mycelium that later on is degraded and reorganized into an aerial mycelium. The hyphae of the aerial mycelium are then separated into spores again. An organism which experiences such considerable changes during growth is in need of an efficient regulation system for morphological and chemical differentiation. For that purpose S. coelicolor employs not only a plethora of sigma and transcription factors, but also a large number of further proteins. During the last years, attention of the scientific community has been drawn more and more to the possibility of modulating gene expression via RNA directly. Such riboregulators are constantly found among all taxa of life in steadily rising numbers. Following the discussion of small non-coding RNAs (sRNAs) being involved in regulation, Vockenhuber et al. performed a bioinformatical search for sRNAs in S. coelicolor [1]. 63 potential sRNAs could be detected and eleven of them were confirmed via Northern blot analysis. Seven of those validated RNAs were chosen for further analysis. The expression of the sRNAs was tested concerning growth phase dependency and response to several stress conditions, as well as the effect of various amino acids and compounds added to the growth media. The expression of those sRNAs showed that they are expressed in a growth phase dependent manner and fold into hoghly structured secondary structures. Overexpression and deletion mutants were created to examine expression levels via Northern blot analysis and proteomic studies. The deletion strains of scr4632 and scr6925 showed a distinct phenotype, though still being in single crossover status. They secreted a golden liquid on top of cells grown on solid, soy-containing, media. Proteome analysis resulted in protein BldKB as a possible target for the sRNAs. Expression analysis of those two sRNAs in overexpression strains showed an influence of the transcripts on each other. Further studies have to be performed on determining direct influence of sRNA transcripts on each other, the secreted substance and its impact on growth and morphology. References [1] Vockenhuber M, Sharma CM, Statt MG et al. (2011) Deep sequencing-based identification of small non-coding RNAs in Streptomyces coelicolor. RNA Biology 8(3): 468–477.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Microbiology and Archaea
10 Department of Biology > Ribogenetics
Date Deposited: 14 Jan 2016 12:44
Last Modified: 03 Aug 2016 07:43
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-52060
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Refereed: 14 December 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5206
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