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Alternative Strategien gegen Malaria mit Hilfe transgener Pflanzen

Pennekamp, Henning :
Alternative Strategien gegen Malaria mit Hilfe transgener Pflanzen.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Alternative Strategien gegen Malaria mit Hilfe transgener Pflanzen
Language: German
Abstract:

Malaria ist eine parasitäre Infektionskrankheit, die durch Plasmodien hervorgerufen und von weiblichen Stechmücken der Gattung Anopheles auf den Menschen übertragen wird. Die Krankheit betrifft vor allem Einwohner tropischer und subtropischer Regionen und führte im Jahr 2013 weltweit zu ungefähr 584000 Todesopfern. Aufkommende Insektizidresistenzen der Anopheles-Mücken, Wirkstoffresistenzen der Plasmodien und das Fehlen effizienter Impfstoffe erschweren maßgeblich die globale Malariakontrolle. Da die konventionellen Methoden keinen nachhaltigen Erfolg bei der Verringerung der Malariaübertragung erzielen, wurden in dieser Arbeit die Grundlagen für zwei alternative Strategien gegen Malaria mit Hilfe transgener Pflanzen untersucht. Neben einer Blutmahlzeit zur Eierproduktion benötigen weibliche Anopheles-Mücken zum Überleben natürliche Zuckerquellen, welche primär aus floralem Pflanzennektar bestehen. Durch die Applikation von genetisch verändertem Nektar, der Wirkstoffe gegen die Entwicklung der Plasmodien innerhalb der Mücken enthält, könnte die Übertragung der Erreger auf Menschen verhindert werden. Dazu wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Produktion von doppelsträngiger RNA durch Tabakpflanzen eine Induzierung von RNA-Interferenz in den Speicheldrüsen der Mücken ermöglicht. Somit könnte die Expression von Genen, die für die Plasmodien zur Speicheldrüseninvasion essentiell sind, herunterreguliert werden. Hierfür wurden zunächst transgene Pflanzen generiert, die sequenzspezifische hairpin-RNAs (hpRNA) zur posttranskriptionellen Inhibierung der Expression des apyrase-Gens produzierten. Eine Applikation von Gesamt-RNA-Extrakten an weibliche Anopheles Mücken zeigte nach einer Analyse mittels quantitativer Real-time-PCR jedoch keine Reduzierung der Genexpression. Ein möglicher Grund dafür könnte die geringe Konzentration der in Pflanzen produzierten hpRNAs sein. Im zweiten Teil der Arbeit wurde daher untersucht, ob die orale Applikation von Nanobodies mit einer Affinität zu Faktor H zur Inhibierung der Plasmodienentwicklung im Mitteldarm der Mücken führen könnte. Die Malariaerreger müssen Faktor H binden, um einer Lyse durch den alternativen Weg des menschlichen Komplementsystems zu entgehen, welches nach der Blutmahlzeit immer noch im Verdauungstrakt des Insektes aktiv ist. Dazu wurden zunächst zwei Phagenbibliotheken mit Hilfe einer zur Verfügung gestellten cDNA-Bibliothek generiert, die aus Blutlymphozyten eines mit Faktor H immunisierten Alpaka/Lama-Hybrids hergestellt worden war. Mit Hilfe eines Phagen-Displays wurden sechs unterschiedliche Nanobodies identifiziert, die gegen Faktor H binden. Nach der Produktion der Nanobodies durch ein bakterielles Expressionssystem, erfolgte deren Charakterisierung mittels ELISA bezüglich ihrer Bindungseigenschaften zu Faktor H. Auf Grund der festgestellten Affinitäten wurde als nächstes mittels einer Analyse durch Bio-Layer-Interferometrie der KD-Wert eines hochaffinen Nanobodies von 1.04×10^9 M festgestellt. Anschließend wurden alle variable domains of camelid heavy chain antibodies (VHHs) mit Hilfe von in vivo Fütterungsversuchen bezüglich ihrer inhibitorischen Wirkung auf den Lebenszyklus der Plasmodien untersucht. Dabei zeigte keiner der verwendeten Nanobodies einen signifikanten inhibitorischen Effekt. Die Gründe dafür könnten sein, dass möglicherweise keiner der Nanobodies an das für die Inhibition essentielle Epitop des Faktor Hs bindet oder dass aufgrund ihrer geringen Größe ein sterischer Effekt zur Blockierung der Bindung an die Malariaerreger ausbleibt. Daher wurde ein Fusionsprotein, bestehend aus dem Nanobody und einem humanen IgG1-Fc-Teil, mit Hilfe eines viralen Expressionssystems in Tabakpflanzen produziert. Anschließend wurde die Affinität des rekombinanten Proteins zu Faktor H mittels ELISA erfolgreich nachgewiesen. Als nächstes müsste das produzierte Fusionsprotein bezüglich seiner Wirkung auf die Entwicklung der Plasmodien mittels eines in vivo Fütterungsexperiments untersucht werden, um anschließend die Produktion in pflanzlichem Nektar durchzuführen. Damit könnte die orale Applikation von VHH-Fc-Fusionsproteinen durch genetisch veränderten Nektar an Anopheles Mücken eine alternative Strategie zur Reduktion der Malariaübertragung auf den Menschen darstellen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Malaria is a parasitic infectious disease caused by plasmodia and transmitted to the human via a bite of a female Anopheles mosquito. The disease mostly affects people in tropical and subtropical regions and, in 2013, caused approx. 584.000 fatalities worldwide. The global malaria control efforts are being consistently hampered due to insecticide resistance development among Anopheles mosquitos, multidrug-resistance of plasmodia and lack of an efficient vaccine. As the conventional methods fail to provide a sustainable reduction of malaria incidence, the aim of this work was to analyze the basic principles of two alternative strategies against the spread of the disease with the use of transgenic plants. Beside their blood meal for the production of eggs, female Anopheles mosquitoes need to take up sugar from natural sources, mostly plant nectar. Through application of genetically altered nectar, containing drugs against the plasmodial development within the mosquitoes, the transmission of the pathogens to the human could be inhibited. Therefore, in the first part of this work, the potential of tobacco-produced double stranded RNA to induce RNA interference in the salivary glands of the mosquitoes was analyzed. Consequently, expression of genes essential for the plasmodia to invade the glands would be downregulated. Thus, transgenic plants producing sequence-specific hairpin RNAs for the post-transcriptional inhibition of the mosquito apyrase gene were generated. Application of total RNA extracts to female Anopheles mosquitoes indicated, after analysis by means of quantitative real time PCR, no downregulation of this gene. One possible reason for this result could be low concentration of the plant-produced hpRNAs. Thus, in the second part of this work, the feasibility of oral application of nanobodies with an affinity to factor H to inhibit the development of the plasmodia within the midgut of the mosquitoes was investigated. The pathogens must bind factor H to evade an induced lysis by the alternative pathway of the human complement system, active in the intestinal tract of the insect following a blood meal. Hence, two phage display libraries were generated relying upon an available cDNA library constructed using lymphocytes of an alpaca/lama-hybrid immunized with factor H. Via phage display technology, six different factor H-binding nanobodies were identified. After production of the nanobodies relying on a bacterial expression system, they were characterized by ELISA regarding their binding properties to factor H. Initial confirmation of antigen-binding properties led to the ultimate determination of the KD value of 1.04×10^9 M for a selected highly affine nanobody via bio-layer interferometry. Subsequently, all six variable domains of camelid heavy chain antibodies (VHHs) were tested in an in vivo transmission blocking assay regarding their inhibitory effect on the life cycle of the plasmodia. However, none of the nanobodies showed significant inhibitory impact. The result could stem from the probable absence of tethering capability of the VHHs to the epitope of factor H constituting the essential binding site for the inhibition of the plasmodial development. Another reason could be that due to their small size nanobodies lack the steric effect necessary for blocking the binding between factor H and the pathogens. Therefore, a fusion protein consisting of the selected nanobody and the human IgG1 Fc domain was produced via a viral-based expression system in tobacco plants. Afterwards, the affinity of the recombinant protein to factor H was verified by the use of ELISA. The next step to analyze the potential inhibitory effect on the plasmodial development would be the execution of another in vivo transmission blocking assay. After verification of their antimalarial impact, the fusion proteins should be produced in plant nectar. Thereby, oral ingestion of the VHH-Fc fusion proteins with transgenically altered nectar by the Anopheles mosquitoes could prove an alternative strategy for the reduction of the transmission of malaria to the human.English
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: Malaria, Anopheles, Plasmodium, Nanobody, RNA-Interferenz, transgene Pflanzen
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Plant Biotechnology and Metabolic Engineering
Date Deposited: 17 Dec 2015 10:57
Last Modified: 17 Dec 2015 10:57
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-52051
Referees: Warzecha, Prof. Dr. Heribert and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 10 December 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5205
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