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Wirkung von ionisierender Strahlung auf Proteom und Lipidom sowie auf zelluläre und mitochondriale Aktivität

Cavlovic, Lidija :
Wirkung von ionisierender Strahlung auf Proteom und Lipidom sowie auf zelluläre und mitochondriale Aktivität.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Wirkung von ionisierender Strahlung auf Proteom und Lipidom sowie auf zelluläre und mitochondriale Aktivität
Language: German
Abstract:

Die Wirkung von ionisierender Strahlung auf die nukleare DNA (nDNA) und die daraus resultierenden Schäden und ihre Reparatur sind, verglichen zu der Wirkung auf die mitochondriale DNA (mtDNA), zellulären Proteine oder auch Lipide und die sich daraus ergebende zelluläre Antwort, umfassender erforscht und verstanden (Leach et al., 2001). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die in vitro Untersuchung von zellulärer Strahlungsantwort, insbesondere der von Mitochondrien. Als experimentelles Modellsystem dienten immortalisierte Oligodendrozyten aus Rattenhirn, OLN-93. Dabei wurde die Wirkung von ionisierender Strahlung in den ersten 14 Tagen nach Bestrahlung der Zellen mit Röntgenstrahlung mit einer Dosis von 8 Gy analysiert. Alle analysierten strahlungsinduzierten Wirkungen wurden stets in einen Vergleich zu entsprechenden unbestrahlten Proben gestellt und diskutiert. Die Untersuchungen umfassten zum einen die Analysen von mitochondrialem Proteom und Lipidom und zum anderen Analysen der physiologischen Merkmale der Zellen, die bekanntlich u.a. mitochondrial gesteuert werden. Die Proteomanalyse erfolgte an nativ isolierten Mitochondrien. Bei der angewandten „crude“ Isolierungsmethode wurde als Priorität die Aufrechterhaltung von strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Mitochondrien und ihren Proteinen gelegt. Somit traten bei nachfolgenden Analysen des mitochondrialen Proteoms als Kontamination ebenfalls nicht mitochondriale Proteine auf. Die Proteomanalyse umfasste: a) Massenspektrometrische Identifizierung von, mittels 2D-BN/SDS Elektrophorese aufgetrennten, Proteinen, b) Die densitometrische Auswertung von Proteinspots auf 2D-BN/SDS Gelen und die Analyse der relativen Proteinmenge in Abhängigkeit von der Bestrahlung (Röntgenstrahlung, 8 Gy) der Zellen und c) Analyse der Aktivität von Komplex I und IV in ihrer individuellen und superkomplexen Form mittels In-Gel Aktivitätstests. Die mittels massenspektrometrischer Peptide Mass Fingerprinting (PMF) Methode durchgeführte Identifizierung von Proteinen aus mitochondrialen Proben von OLN-93 Zellen in 2D-BN/SDS Gel lieferte, im Anbetracht der allgemein gültigen Schwierigkeiten die bei den Zellkulturproben auftreten (im Vergleich zu Gewebeproben bei gleicher Proteinmenge ist die Anzahl der Proteinspots deutlich kleiner und diese sind wesentlich schwächer sichtbar nach jeglichen Färbeverfahren), ausgesprochen zufriedenstellende Resultate. Insgesamt 98 Proteine wurden aus dem Gel extrahiert und analysiert. Erfolgreich war die Identifizierung von 63 Proteinspots, darunter erwiesen sich 27, laut der Datenbank, als mitochondriale Proteine. Die quantitative Analyse der Proteinmenge wurde für einige OxPhos- und Hitzeschockproteine (HSP) durchgeführt. Die densitometrische Auswertung der SYPRO-Ruby gefärbten Proteinspots auf 2D-BN/SDS Gelen erfolgte mittels Delta2D Software. Dabei konnte gezeigt werden, dass die ionisierende Strahlung einen reduzierenden Einfluss auf die Menge der Komplexe und Superkomplexe der oxidativen Phosphorylierung hat. Im Falle von HSPs zeigte sich strahlungsabhängig die Zunahme der Menge für das HSP60 und HSP90β Protein, während die Menge vom Hyou1 (Mitglied der HSP70 Proteinfamilie) unbeeinflusst blieb. Die aufgetretenen Änderungen waren stets ausgeprägter zu den analysierten Zeiten, die näher an dem Zeitpunkt der Bestrahlung lagen (Tag 1 und 4 nach der Bestrahlung). Weiterhin wurde die Wirkung von ionisierender Strahlung auf das mitochondriale Proteom bei den Untersuchungen der enzymatischen Aktivität der Komplexe I und IV beobachtet. Dabei zeigte sich eine Abnahme der relativen Enzymaktivität für den individuellen Komplex I, sowie für den Komplex I in den Superkomplexen. Die Abnahmen waren dabei für den individuellen Komplex stärker ausgeprägt. Die relative enzymatische Aktivität vom Komplex IV war dagegen strahlungsabhängig erhöht. Die Erhöhung der relativen enzymatischen Aktivität war für Komplex IV in Superkomplexen größer als für den individuellen Komplex. Die Untersuchung der Wirkung von ionisierender Strahlung auf das mitochondriale Lipidom erfolgte durch: a) Analyse der Membranfluidität mittels Fluoreszenz-Anisotropie der in der Membran befindlichen Fluoreszenzsonden und b) MALDI-TOF MS Analyse der Membran-Lipidzusammensetzung an intakten Mitochondrien. Es zeigte sich bei der Analyse der „Fluidität“ der mitochondrialen Membranen statistisch signifikante Wirkung von ionisierender Strahlung. Dabei blieb diese strahlungsinduzierte Änderung für die gesamte Zeitspanne von 14 Tagen nach der Bestrahlung bestehen. Die Anisotropie-Werte der bestrahlten Proben waren durchschnittlich um 0,02 niedriger als die von unbestrahlten Proben, was eine strahlungsinduzierte Erhöhung der Membranfluidität widerspiegelt. Diese Änderungen konnten als ein für die Mitochondrien spezifischen Effekt der ionisierenden Strahlung beobachtet werden, denn die Analysen der Fluidität der Zellmembran ergaben keine strahlungsabhängige Unterschiede. Die ionisierende Strahlung scheint keinen Einfluss auf die Lipidzusammensetzung der mitochondrialen Membranen zu haben. Dies konnte während der Zusammenarbeit mit Frau Stefanie Kern (Kern, 2013b) und Herrn Michael Muschol (Muschol, 2014) im Rahmen der Etablierung der innovativen massenspektrometrischen Methode zur Analyse der Lipidzusammensetzung an intakten Mitochondrien gezeigt werden. Um die zellulären und mitochondrialen Aktivitäten zu untersuchen, erfolgte eine Reihe von Experimenten, die alle entweder durchgehend über die analysierte Zeitspanne, oder nur zu bestimmten Zeitpunkten strahlungsinduzierte Änderungen zeigten. So konnte eine mit der Zeit nach der Bestrahlung kleiner werdende Zunahme in der ATP Menge in bestrahlten Zellen beobachtet werden. Dieses Ergebnis wurde in zwei unabhängigen Experimenten beobachtet. Eine dritte Wiederholung ergab allerdings nur eine Zunahme der ATP Menge für den Tag 1 nach der Bestrahlung, während bei späteren Zeiten die ATP Menge strahlungsabhängig unbeeinflusst blieb. Weiterhin wurden eine Zunahme der ROS Menge und eine Hyperpolarisation des mitochondrialen Membranpotentials am Tag 1 nach der Bestrahlung beobachtet, aber auch zu anderen Zeiten nach der Bestrahlung zeigten sich strahlungsinduzierte Änderungen. Die ionisierende Strahlung wirkte sich außerdem auf das Wachstum der Zellpopulation, sowie auf zelluläre metabolische und endozytosolische Aktivitäten aus. Einen umstrittenen Parameter bei den Strahlungsstudien in konventionell in vitro kultivierten Zellen stellt der Sauerstoffgehalt dar. Um die Bedeutung von Sauerstoffgehalt auf die Strahlungsantwort der Zellen in solchen Studien zu erforschen, werden oft u.a. chemische Hypoxie-Nachahmer eingesetzt. In Rahmen dieser Arbeit wurden Experimente ebenfalls unter Einsatz von dem in der Literatur bekannten chemischen Hypoxie-Nachahmer CoCl2 durchgeführt. Dabei wurde die Wirkung von ionisierender Strahlung abhängig von der Zugabe von 300 µM CoCl2 zum Nährmedium analysiert. Weiterhin wurden die gefundenen Effekte des CoCl2 auf die Strahlungsantwort kritisch in Vergleich gezogen mit den aus der Literatur bekannten Effekten der realen Hypoxie (tatsächlich verminderter Sauerstoffgehalt). Die Ergebnisse zeigten, dass CoCl2 einen mildernden bzw. umkehrenden Effekt auf die Strahlungsantwort der Zellen hat. Bei der Analyse der mitochondrialen Membranfluidität wurde festgestellt, dass die strahlungsinduzierte Erhöhung in CoCl2 behandelten Zellen nicht auftrat. Weiterhin konnte die beobachtete strahlungsinduzierte Erhöhung der ROS Menge, wie auch von dem mitochondrialen elektrochemischen Potential in Gegenwart von CoCl2 nicht detektiert werden. CoCl2 hatte einen Effekt auf die Lipidzusammensetzung der mitochondrialen Membranen, unabhängig von der Aussetzung der Zellen ionisierender Strahlung. Im Vergleich zu vielen früheren Studien zur Analyse der Wirkung der realen Hypoxie auf die Strahlenresistenz kann gesagt werden, dass der mildernde und umkehrende Einfluss von CoCl2 mit diesen teilweise in Einklang steht. Auf molekularer Ebene bewirkt CoCl2 die Inhibierung von Prolyl-Hydroxylasen (PHDs) mit der Folge der Stabilisierung des HIF-1 Transkriptionsfaktors, welcher wiederum zur Aktivierung zahlreicher Gene führt und somit u.a. Strahlenresistenz bewirken kann. Die reale Hypoxie führt zur Stabilisierung von HIF-1 Transkriptionsfaktor, außer durch die Inaktivierung von PHDs, noch über mehrere Ebenen und erhöht dazu seine Translation und Transaktivierungsaktivität. Aus diesen Gründen und aufgrund zum Teil unbekannten Hypoxie-unähnlichen Einflüssen von CoCl2 auf die Zellen kann zusammenfassend die Benutzung von CoCl2 als Hypoxie-Nachahmer als ungeeignet angesehen werden.

Kernaussagen dieser Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: Die ionisierende Strahlung (Röntgenstrahlung, 8 Gy) beeinflusst viele der in dieser Arbeit untersuchten Parameter. Die Mitochondrien stellen ein sehr wichtiges Target für die ionisierende Strahlung dar und in Anbetracht ihrer vielseitigen Einflüsse und Involvierung in die Steuerung der zellulären Prozesse (Apoptose, ATP Produktion, usw.), beeinflussen diese die gesamte zelluläre Antwort auf die Strahlung, aber auch auf andere Stressfaktoren. Die konventionelle in vitro Kultivierung von Zellen ist, insbesondere aufgrund des erhöhten Sauerstoffgehalts, kritisch zu betrachten. Die Untersuchungen der zellulären Antwort auf die low-LET Strahlung, zu der auch Röntgenstrahlungen zählen, sollen unter möglichst physiologischen Sauerstoffbedingungen durchgeführt werden, da diese zum größten Teil die Zellen durch indirekte Wirkung schädigen. Diese Schäden sind häufig, abhängig von dem zellulären Sauerstoffgehalt, für die Zellen apoptotisch (irreparabel) oder reparabel.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The impact of ionizing radiation on the nuclear DNA (nDNA), the resulting damages and its repairs are, compared to the impact on mitochondrial DNA (mtDNA), cellular proteins or lipids and the resulting cellular response, more comprehensive researched and understood (Leach et al., 2001). The aim of this study was the in vitro study of cellular radiation response, especially on the mitochondria. Immortalized OLN-93 cells from rat brain were used as the experimental model system. The effects of ionizing radiation were analysed within 14 days after irradiation with X-ray at a dose of 8 Gy. Corresponding non-irradiated samples were used as reference group. The analyses of mitochondrial proteome and lipidome, as well as analysis of the physiological properties of the cells, which are controlled by mitochondria, were performed. The proteome analysis was performed on native isolated mitochondria. The set priority during the "crude" isolation of mitochondria, was maintaining the structural and functional properties of mitochondria and their proteins. For that reason appeared in subsequent analyzes also non-mitochondrial proteins as a contamination. Proteome analysis included: a) mass spectrometric identification of proteins, separated by 2D-BN/SDS electrophoresis, b) densitometric analysis of protein spots on the 2D-BN/SDS gels and the analysis of the relative amount of proteins changed due to the irradiation of cells (X-rays, 8 Gy) and c) analysis of complex I and IV activity using in-gel activity assays that allow distinguishing between their individual and supercomplex formation. The mass spectrometric peptide mass fingerprinting (PMF) method was used for the identification of mitochondrial proteins from OLN-93 cells in 2D-BN/SDS gel and considering the general problems that occur in cell culture samples (compared to tissue samples with the same amount of protein is the number of protein spots clearly smaller and less visible after any dyeing process) were the resultants very satisfying. Altogether 98 proteins were analysed and extracted from the gel. 63 protein spots could successfully be identified, including 27 mitochondrial proteins. The quantitative analysis was performed for a few OxPhos and heat shock proteins (HSP). This showed that the ionizing radiation decreased the amount of OxPhos complexes and supercomplexes. In the case of HSPs a radiation-induced increase in the amount of HSP60 and HSP90β proteins was detected, while the amount of Hyou1 (member of the HSP70 family of proteins) remained unaffected. The effects were strongest 1 and 4 days after irradiation and diminished with time. Additionally, relative enzyme activity was decreased for complex I, both in the individual and assembled in the supercomplexes forms. The decreases were more distinctive for individual complex. The relative enzymatic activity of complex IV increased after irradiation. This effect was stronger for complex IV in supercomplexes than for the individual complex. The investigation of the effect of ionizing radiation on the mitochondrial lipidom was carried out by: a) analysis of membrane fluidity by fluorescence anisotropy of fluorescent probes embedded in the membrane und b) MALDI-TOF MS analysis of membrane lipid composition on intact mitochondria. It was found that ionizing radiation statistically significant increases the mitochondrial membranes fluidity and this effect was observed for the entire period of 14 days after the irradiation. The anisotropy values of the irradiated samples were on average by 0.02 lower than the values of unirradiated samples, reflecting a radiation-induced increase in membrane fluidity. These changes could be considered as a specific effect of irradiation for mitochondria, because the analysis of the fluidity of the cell membrane revealed no radiation-dependent differences. On the other hand, the ionizing radiation appears to have no effect on the lipid composition of the mitochondrial membranes. This could be shown in the context of the establishment of innovative mass spectrometric method for the analysis of the lipid composition on intact mitochondria during collaboration with Mrs. Stefanie Kern (Kern, 2013b) and Mr. Michael Muschol (Muschol, 2014). A series of experiments was carried out in order to examine the cellular and mitochondrial activity and them all showed radiation-induced changes either continuously during the analysis, or only at specific times. So could be seen that irradiation, initially increased ATP amount and this effect diminished with time. This result was observed in two independent experiments. However, a third repetition showed only an increase in the ATP amount for the day 1 after irradiation, while in later times the amount of ATP was radiation dependent unaffected. Furthermore, an increase of ROS amount and hyperpolarization of the mitochondrial membrane potential was observed at day 1 after irradiation. The ionizing radiation also showed an impact on the growth of the cell population, as well as on the cellular metabolic and endocytosolic activities. The oxygen content for cultured in vitro cells represents a controversial parameter in the radiation studies. To investigate the importance of oxygen amount to the irradiation response of the cells I used the cobalt (II) chloride, CoCl2, a well-known chemical hypoxia mimic in the literature. The effect of ionizing radiation was analyzed depending on the addition of 300 µM CoCl2 into the nutrient medium. Furthermore, the resulting effects were critically compared to the, from the literature known, impact of real hypoxia (in fact reduced oxygen content). The results showed that CoCl2 weakens or inverts the effects of irradiation response in the cells. The analysis of the mitochondrial membrane fluidity discovered that the radiation-induced increase did not occur in CoCl2-treated cells. Furthermore, it was observed that the radiation-induced increase of ROS amount cannot be detected as well as the mitochondrial electrochemical potential in the presence of CoCl2. CoCl2 effected the lipid composition of mitochondrial membranes independent from the treatment of cells with ionizing irradiation. In comparison to many previous studies for investigation of the real hypoxia effect on the radiation resistance could be demonstrated that the weakening and inverting influence of CoCl2 with these partially complies. CoCl2 effects at the molecular level the inhibition of prolyl hydroxylases (PHD), with the result of the stabilization of HIF-1 transcription factor, which in turn leads to the activation of many genes. It can also cause radiation resistance. The real hypoxia leads to stabilization of HIF-1 transcription factor, except by the inactivation of PHD, even across multiple levels and increases its translation and transactivation activity. For these reasons, and due partly unknown hypoxia-dissimilar influences of CoCl2 on the cells, can be summarized that the use of CoCl2 as hypoxia mimetic is unsuitable. Results of this study can be summarized as follows: The ionizing radiation at the dose of 8 Gy (X-rays) influences many parameters of mitochondrial functioning. Mitochondria represent a very important target for ionizing radiation especially in regards to their involvement in the control of cellular processes (apoptosis, ATP production, etc.), affecting these total cellular response to radiation, but also to other stressors. The conventional in vitro cultivation of cells is to be considered especially critical, due to of the increased oxygen content. Studies of the cellular response to the low-LET radiation, which includes X-rays, are to be carried out under physiological oxygen conditions because they cause damage to the cells mostly by indirect effect. It often depends from the cellular oxygen content if these damages are apoptotic (irreparable) or reparable for the cell.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 02 Nov 2015 13:07
Last Modified: 02 Nov 2015 13:07
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-50313
Referees: Dencher, Prof. Dr. Norbert A. and Schmidt, Prof. Dr. Boris
Refereed: 13 July 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5031
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